本文關(guān)鍵詞：新型多房棘球蚴亞單位疫苗CTB-Emy162的研究

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【摘要】：目的構(gòu)建融合基因CTB-Emy162原核表達系統(tǒng),純化得到融合蛋白。建立多房棘球蚴亞單位疫苗CTB-Emy162的動物模型,觀察亞單位疫苗CTB-Emy162免疫原性和抗原性。方法根據(jù)多房棘球蚴抗原Emy162在Gen Bank中的序列,用OptimumTM Codon軟件優(yōu)化Emy162,從而獲得適合大腸桿菌BL-21表達的Emy162基因序列。PCR擴增Emy162基因,利用分子生物學技術(shù)與免疫佐劑霍亂毒素B亞基(CTB)相偶聯(lián)。設(shè)計出一個科學合理的亞單位疫苗CTB-Emy162。構(gòu)建CTB和Emy162雙基因原核表達質(zhì)粒p ET-28a-CTB-Emy162,將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于E.coli BL-21(DE3)中,經(jīng)IPTG誘導蛋白表達后,利用Ni-NTA柱親和層析結(jié)合離子交換色譜法純化后獲得的蛋白。在獲得蛋白CTB-Emy162基礎(chǔ)上,建立實驗組及對照組的動物模型:將純化后的重組蛋白CTB-Emy162免疫SPF級BALB/c小鼠作為實驗組,PBS免疫作為對照組。采用脾淋巴細胞增殖、ELISA等方法確證重組蛋白CTB-Emy162的免疫原性和特異性。結(jié)果成功構(gòu)建重組蛋白CTB-Emy162的原核表達載體,并獲得純化后的重組蛋白CTB-Emy162。經(jīng)脾淋巴細胞增殖實驗、ELISA等分子生物學和免疫學方法證實CTB-Emy162有良好的免疫原性和抗原活性。結(jié)論經(jīng)原核表達的多房棘球蚴亞單位疫苗CTB-Emy162具有良好抗原性和免疫效果,有可能為預(yù)防和治療多房棘球蚴病提供新的疫苗。
【關(guān)鍵詞】：多房棘球蚴病 霍亂毒素 B 亞基 CTB-Emy162 亞單位疫苗
【學位授予單位】：青海大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R532.3
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 主要符號對照表10-11
• 第1章 引言11-14
• 1.1 棘球絳蟲和棘球蚴病11
• 1.2 棘球蚴病的流行范圍和特點11-12
• 1.3 棘球蚴病的診療現(xiàn)狀12-14
• 第2章 多房棘球蚴抗原Emy162序列獲得與優(yōu)化14-21
• 2.1 實驗材料14-16
• 2.1.1 實驗材料14
• 2.1.2 主要試劑14-15
• 2.1.3 試劑配制15
• 2.1.4 實驗儀器15-16
• 2.2 實驗方法16-17
• 2.2.1 Emy162序列的獲得及優(yōu)化16
• 2.2.2 Emy162核苷酸序列的基因合成16-17
• 2.2.3 PCR產(chǎn)物的回收17
• 2.3 實驗結(jié)果17-19
• 2.3.1 Emy162序列的優(yōu)化17-18
• 2.3.2 Emy162基因的c DNA序列的擴增18-19
• 2.4 討論19-20
• 2.5 結(jié)論20-21
• 第3章 多房棘球蚴亞單位疫苗CTB-Emy162載體構(gòu)建21-32
• 3.1 實驗材料21-23
• 3.1.1 Emy162氨基酸序列21
• 3.1.2 免疫佐劑霍亂毒素B亞基（CTB）21-22
• 3.1.3 質(zhì)粒的獲取22
• 3.1.4 主要試劑22-23
• 3.1.5 實驗儀器23
• 3.2 實驗方法23-26
• 3.2.1 CTB-Emy162間隔序列選擇及偶聯(lián)設(shè)計23-24
• 3.2.2 重組表達載體p ET-CTB-Emy162的構(gòu)建24-26
• 3.2.2.1 Emy162基因的合成24
• 3.2.2.2 Emy162重組質(zhì)粒載體構(gòu)建24-25
• 3.2.2.3 重組質(zhì)粒p ET-CTB-Emy162的鑒定25-26
• 3.3 實驗結(jié)果26-30
• 3.3.1 CTB-Emy162間隔序列選擇及偶聯(lián)設(shè)計26
• 3.3.2 亞單位疫苗CTB-Emy162偶聯(lián)設(shè)計26-27
• 3.3.3 亞單位疫苗CTB-Emy162間隔序列設(shè)計27-28
• 3.3.4 重組質(zhì)粒載體p ET-CTB-Emy162的構(gòu)建28-30
• 3.3.4.1 經(jīng)優(yōu)化后的基因Emy162的合成28
• 3.3.4.2 載體p ET-CTB-Emy162的構(gòu)建及鑒定28-29
• 3.3.4.3 載體p ET-CTB-Emy162的核苷酸測序29-30
• 3.4 討論30-31
• 3.5 結(jié)論31-32
• 第4章 多房棘球蚴亞單位疫苗CTB-Emy162的表達與純化32-40
• 4.1 實驗材料32-34
• 4.1.1 主要試劑32-33
• 4.1.2 主要溶液及配方33-34
• 4.1.3 實驗儀器34
• 4.2 實驗方法34-36
• 4.2.1 基因工程菌株的誘導表達及鑒定34-35
• 4.2.1.1 重質(zhì)粒p ET-CTB-Emy162的轉(zhuǎn)化34-35
• 4.2.1.2 基因工程重組菌株的誘導35
• 4.2.1.3 重組蛋白CTB-Emy162的分離、表達部位及形式的鑒定35
• 4.2.1.4 誘導表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測35
• 4.2.2 重組蛋白CTB-Emy162的Ni-NTA柱純化35-36
• 4.2.3 重組蛋白CTB-Emy162的透析復(fù)性和濃縮36
• 4.3 實驗結(jié)果36-38
• 4.3.1 基因工程菌株的誘導表達及鑒定36-37
• 4.3.2 重組蛋白CTB-Emy162的Ni-NTA親和層析純化37-38
• 4.4 討論38-39
• 4.5 結(jié)論39-40
• 第5章 多房棘球蚴亞單位疫苗CTB-Emy162免疫性研究40-50
• 5.1 實驗材料40-42
• 5.1.1 CTB-Emy162等蛋白的獲取40
• 5.1.2 實驗動物40
• 5.1.3 主要試劑40-41
• 5.1.4 主要溶液及配方41-42
• 5.1.5 實驗儀器42
• 5.2 實驗方法42-44
• 5.2.1 BALB/c小鼠的免疫接種42-43
• 5.2.2 CTB-Emy162與GM1的結(jié)合活性43
• 5.2.3 ELISA檢測特異性抗體43
• 5.2.4 小鼠脾臟淋巴細胞增殖實驗43-44
• 5.3 實驗結(jié)果44-48
• 5.3.1 亞單位疫苗CTB-Emy162與GM1結(jié)合活性的檢測44-45
• 5.3.2 CTB-Emy162特異性抗體的檢測45-46
• 5.3.3 小鼠脾臟淋巴細胞增殖反應(yīng)的檢測46-47
• 5.3.4 Ig G1、Ig G2a和Ig A特異性抗體的檢測47-48
• 5.4 討論48-49
• 5.5 結(jié)論49-50
• 全文總結(jié)50-51
• 不足與創(chuàng)新51-52
• 參考文獻52-64
• 致謝64-65
• 綜述65-76
• 參考文獻71-76
• 作者簡介76

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本文編號：908257