發(fā)布時(shí)間：2017-09-23 07:37

  本文關(guān)鍵詞：基于高豐度轉(zhuǎn)錄本的細(xì)菌RT-qPCR檢測技術(shù)及其應(yīng)用

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【摘要】：近些年來,隨著結(jié)核桿菌病的死灰復(fù)燃以及超級細(xì)菌的出現(xiàn),時(shí)刻提醒著人們細(xì)菌性傳染病仍然是人類生命健康的重大威脅。傳染病的早期診斷是開展治療和防控的前提,是預(yù)防控制傳染病的首要任務(wù)。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,人們發(fā)明了各種檢測和診斷疫病的方法,如傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法、免疫檢測法、分子生物學(xué)檢測方法等。分子生物學(xué)檢測方法是現(xiàn)代檢測致病微生物的檢測核心技術(shù),尤以PCR技術(shù)為代表,其具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)、且具有多種廣泛的應(yīng)用形式等優(yōu)點(diǎn)。然而眾多PCR衍生技術(shù)均是以基因組為檢測靶標(biāo)的方法,這些方法在檢測病毒性致病微生物上很靈敏,但在檢測細(xì)菌性致病微生物時(shí)卻受到了一定的限制。因細(xì)菌基因組拷貝數(shù)等于細(xì)菌的數(shù)量,臨床上一些細(xì)菌在宿主內(nèi)的數(shù)量有限,尤其是胞內(nèi)寄生菌,從而限制了分子生物學(xué)的檢測。因此,提高這類病原的檢測具有重要意義。編碼基因在表達(dá)的時(shí)候,會轉(zhuǎn)錄出不同豐度的RNA,對于高表達(dá)的基因,其轉(zhuǎn)錄的m RNA豐度遠(yuǎn)高于編碼基因本身。因此我們假設(shè),如果將高表達(dá)的基因以及它轉(zhuǎn)錄出的m RNA作為檢測的靶標(biāo),就有可能大大提高細(xì)菌檢測的靈敏性。而根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄PCR的原理,它有可能滿足同時(shí)對DNA和RNA進(jìn)行擴(kuò)增的要求。且逆轉(zhuǎn)錄PCR已經(jīng)在病毒性微生物的檢測中以及活菌的檢測中得到普遍應(yīng)用,但在細(xì)菌性致病微生物的檢測中尚未見到報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以馬耳他布魯氏菌16M為模型菌,提取16M的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序?qū)ふ腋弑磉_(dá)基因,并將此基因與它轉(zhuǎn)錄生成的m RNA作為檢測靶標(biāo),利用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法,實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌性致病微生物快速靈敏的檢測。為了比較基于轉(zhuǎn)錄本檢測的實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR方法的可行性,我們比較了RT-q PCR和q PCR對DNA和RNA的擴(kuò)增效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn):RT-q PCR方法既可以對DNA進(jìn)行有效擴(kuò)增又可以對RNA進(jìn)行有效擴(kuò)增,而q PCR方法只能對DNA進(jìn)行有效擴(kuò)增。然而,在比較RT-q PCR對DNA和RNA的擴(kuò)增效率時(shí),我們發(fā)現(xiàn)RT-q PCR對RNA擴(kuò)增的CT值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對DNA擴(kuò)增的CT值,這與理論不符。為此我們比較了RNA的濃度用DNA酶處理前后的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用Trziol裂解法所提取的RNA中存在著嚴(yán)重的DNA的污染,且該方法所提取的RNA效率低,只有22.7%是RNA分子,不足以用于RT-q PCR方法的檢驗(yàn)。為了提高RT-q PCR的檢測效率,我們用一種簡單的熱變性方法處理樣本,得到總核酸,再分別進(jìn)行RT-q PCR和q PCR實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),RT-q PCR實(shí)驗(yàn)檢測總核酸的CT值比q PCR檢測總核酸的CT值小5個(gè)數(shù)值,說明該種方法可以避免RNA損失,提高了RT-q PCR方法的檢測效率。為了進(jìn)一步比較應(yīng)用熱變性處理樣品后RT-q PCR方法和q PCR方法檢測的靈敏性,我們將16M總核酸進(jìn)行10倍梯度稀釋,結(jié)果表明,對于每一個(gè)梯度稀釋的總核酸,RT-q PCR方法檢測的CT值都要比q RCR方法檢測的CT值小5個(gè)數(shù)值,且RT-q PCR方法的檢測下限低于q PCR方法的檢測下限。為了找到合適的靶基因?qū)?6M進(jìn)行檢測,我們對其他的候選基因進(jìn)行比較分析,結(jié)果表明,基因BMEI1305的檢測效果最佳,可作為應(yīng)用RT-q PCR方法檢測馬耳他布魯氏桿菌16M的靶標(biāo)。為了評價(jià)RT-q PCR檢測方法在臨床樣本上的敏感性,我們對10名血清學(xué)檢測為陽性的布病患者的血液進(jìn)行了比較評價(jià),發(fā)現(xiàn)在這10份樣品中,應(yīng)用q PCR方法檢測出4份樣品為陽性;應(yīng)用RT-q PCR方法檢測出6份樣品為陽性。這些數(shù)據(jù)表明,在布病的診斷中,RT-q PCR的檢測靈敏性和準(zhǔn)確性高于q PCR的檢測方法,可以減少假陰性率的發(fā)生。為了評價(jià)該方法是否具有通用性,我們在五種致病性細(xì)菌上較了q PCR和RT-q PCR的檢測效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在這五種細(xì)菌中RT-q PCR的檢測方法比q PCR的檢測方法都靈敏。表明RT-q PCR可以作為一種通用的檢測方法。綜上,以轉(zhuǎn)錄本為基礎(chǔ)的RT-q PCR檢測方法在對細(xì)菌性致病微生物的檢測上具有靈敏性高,特異性好,且具有通用性等特點(diǎn),可以為作為輔助臨床診斷的檢測方法。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)錄本 細(xì)菌 檢測 逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R52;R440
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文縮寫詞表11-12
• 引言12-14
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述14-25
• 第1章 傳染性疾病的流行現(xiàn)狀14-17
• 第2章 細(xì)菌檢測方法的研究現(xiàn)狀17-25
• 2.1 傳統(tǒng)的細(xì)菌檢測方法17-18
• 2.2 免疫學(xué)檢測方法18-20
• 2.3 分子生物學(xué)檢測方法20-25
• 第二篇 研究內(nèi)容25-54
• 第1章 基于轉(zhuǎn)錄本檢測技術(shù)原理的闡述25-27
• 第2章 靶標(biāo)基因的篩選及RT-qPCR擴(kuò)增效率的驗(yàn)證27-40
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料27-28
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法28-33
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-37
• 2.4 討論37-40
• 第3章 基于轉(zhuǎn)錄本檢測技術(shù)原理的驗(yàn)證40-49
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法40-43
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-47
• 3.4 討論47-49
• 第4章 基于轉(zhuǎn)錄本檢測方法的通用性驗(yàn)證49-54
• 4.1 材料49
• 4.2 方法49-52
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-53
• 4.4 討論53-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 附錄61-65
• 導(dǎo)師簡介65-67
• 作者簡介67-68
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文68-69
• 致謝69

【相似文獻(xiàn)】

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1 李黎;5′外顯子及多聚嘌呤化位點(diǎn)的變換可使單拷貝基因產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄本[J];國外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊);1994年01期

2 史常永;清·嘉慶11年(1806年)朱潤轉(zhuǎn)錄本,薛雪撰,1卷。[J];山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2003年02期

3 符爽;孫開來;富偉能;;MYCT1新轉(zhuǎn)錄本的克隆與表達(dá)分析[J];中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2014年05期

4 邵康,赫捷,程邦昌,肖智雄,張德超,黃微,張翠艷,周芳,熊美華,唐槐靜,石素勝,姆巴東;RASSF1基因不同轉(zhuǎn)錄本在肺癌組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及臨床意義[J];中華腫瘤雜志;2003年02期

5 林江 ,錢軍 ,張永寧 ,季勇慧 ,吳朝陽 ,費(fèi)霞 ,王法春 ,唐華容 ,江云偉;應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測慢性粒細(xì)胞白血病患者p210~(bcr/abl)轉(zhuǎn)錄本的臨床意義[J];陜西醫(yī)學(xué)雜志;2004年12期

6 王旭;張帆;徐艷;吳秀麗;陳少華;楊力建;李，

本文編號：904028