發(fā)布時(shí)間：2017-09-20 15:23

  本文關(guān)鍵詞：伯氏疏螺旋體重組膜蛋白A對(duì)人白血病T淋巴細(xì)胞株的體外作用及對(duì)昆明小鼠體內(nèi)作用的研究

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【摘要】：研究目的：1.本實(shí)驗(yàn)以人白血病T淋巴細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞為模型,利用蛋白芯片技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzymes linked immunosorbent assay,Elisa)及實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù),研究伯氏疏螺旋體重組膜蛋白A (recombinant Borrelia burgdorferi membrane protein A,rBmpA)刺激Jurkat細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子及刺激昆明小鼠關(guān)節(jié)產(chǎn)生趨化因子的作用,以探索rBmpA與萊姆關(guān)節(jié)炎發(fā)病的關(guān)系。2.以人白血病T淋巴細(xì)胞株Jurkat細(xì)胞為模型,用ELISA方法檢測(cè)經(jīng)rBmpA刺激后Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子：白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素-17A (IL-17A)及腫瘤壞死因子TNF-a,從細(xì)胞水平探討rBmpA致萊姆關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。3.以伯氏疏螺旋體重組膜蛋白A (recombinant Borrelia burgdorferi membrane protein A,rBmpA)刺激昆明小鼠關(guān)節(jié)造模,參照高通量抗體蛋白芯片篩選結(jié)果,采用RT-PCR方法檢測(cè)經(jīng)rBmpA刺激后小鼠關(guān)節(jié)及血中趨化因子：(MIP-1 α/CCL3)及(SDF-1 α/CXCL12)的表達(dá)水平,從基因水平探討rBmpA致萊姆關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。研究方法：1、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞[培養(yǎng)基為5%RPMI-1640培養(yǎng)基,細(xì)胞濃度5×105/mL,體積1ml],培養(yǎng)6-12小時(shí)后,待細(xì)胞適應(yīng)后,用100μg/mL植物血凝素PHA及80μg/mL rBmpA分別處理Jurkat細(xì)胞,在作用12小時(shí)、24小時(shí)后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。2、用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A、TNF-α)的表達(dá)量。3、將昆明小鼠隨機(jī)分為三組：實(shí)驗(yàn)組(0.005mg/ml)、對(duì)照組(0.01M PBS)、空白組(不予任何處理),左右腿均50ul,7天、14天分批處理,分別收集小鼠關(guān)節(jié)液及眼角血液,參照高通量抗體蛋白芯片篩選結(jié)果,采用RT-PCR法分別檢測(cè)關(guān)節(jié)液及眼部血液中趨化因子(MIP-1 α/CCL3)及(SDF-1 α/CXCL12)基因mRNA的表達(dá)水平。4、設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增目的基因(MIP-1 α/CCL3)及(SDF-1α/CXCL12)和內(nèi)參基因(GAPDH),將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測(cè)趨化因子(MIP-1 α/CCL3)及(SDF-1 α/CXCL12)mRNA轉(zhuǎn)錄水平,利用計(jì)算相對(duì)表達(dá)量法進(jìn)行相對(duì)定量分析,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。研究結(jié)果：1、本次研究成功探索出人白血病T淋巴細(xì)胞株(jurkat細(xì)胞)體外培養(yǎng)條件、方法及注意事項(xiàng)。2、本次研究用rBmpA刺激昆明小鼠關(guān)節(jié)造模,成功建立了小鼠萊姆關(guān)節(jié)炎模型。3、ELISA結(jié)果顯示：80 μ g/mL的rBmpA和100 μ g/mL的PHA都可以誘導(dǎo)人白血病T淋巴細(xì)胞株(jurkat細(xì)胞)活化分泌釋放細(xì)胞因子IL-4和IL-17A,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4、用ELISA法分別檢測(cè)rBmpA刺激小鼠萊姆關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型試驗(yàn)的小鼠血清上清液及關(guān)節(jié)勻漿液的IL-17含量,結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組(rBmpA組)IL-17含量明顯高于對(duì)照組(PBS組)和空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p0.05。5、通過(guò)蛋白芯片技術(shù)對(duì)25種小鼠趨化因子進(jìn)行檢測(cè),成功篩選出CCL3和CXCL16兩個(gè)趨化因子做后續(xù)的研究。6、小鼠血清上清液和關(guān)節(jié)勻漿液趨化因子CCL3 mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果均表明：7d后和14d后,實(shí)驗(yàn)組(rBmpA組),對(duì)照組(PBS組),空白組三組之間CCL3基因mRNA相對(duì)表達(dá)量之間存在差異,rBmpA組CCL3基因mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。7、小鼠關(guān)節(jié)勻漿液趨化因子CXCL16 mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果也表明,實(shí)驗(yàn)組(rBmpA組),對(duì)照組(PBS組),空白組三組之間CXCL16基因mRNA相對(duì)表達(dá)量之間存在差異,rBmpA組CXCL16基因mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論：1、本次研究成功探索出人白血病T淋巴細(xì)胞株(jurkat細(xì)胞)體外培養(yǎng)方法,同時(shí)成功建立了小鼠萊姆關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。2、體外研究(rBmpA刺激人類(lèi)白血病T淋巴細(xì)胞株(Jurkat細(xì)胞)誘導(dǎo)其活化分泌釋放細(xì)胞因子IL-4和IL-17A)和體內(nèi)研究(萊姆關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中rBmpA刺激炎性因子IL-17, CCL3, CXCL16的變化)都證明了：rBmpA與萊姆關(guān)節(jié)炎的發(fā)生機(jī)制有關(guān),同時(shí)也說(shuō)明細(xì)胞因子、趨化因子與萊姆病關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：關(guān)節(jié)萊姆病 rBmpA 人白血病T淋巴細(xì)胞Jurkat 細(xì)胞因子 趨化因子
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R514
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 相關(guān)縮略詞12-14
• 引言14-20
• 1.1 萊姆病臨床癥狀及診斷14-15
• 1.2 伯氏疏螺旋體及伯氏疏螺旋體膜蛋白A(BmpA)15-17
• 1.3 萊姆病關(guān)節(jié)炎致病機(jī)理17-19
• 1.4 實(shí)驗(yàn)?zāi)康募耙饬x19-20
• 第一部分 伯氏疏螺旋體重組膜蛋白A(rBmPA)對(duì)人白血病T淋巴細(xì)胞株的體外作用20-34
• 1、人白血病T淋巴細(xì)胞株(jurkat細(xì)胞)體外培養(yǎng)方法20-26
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料及主要溶液20-23
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法23-24
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-26
• 2、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Elisa)檢測(cè)rBmpA刺激小人白血病T淋巴細(xì)胞株(jurkat細(xì)胞)產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響26-34
• 2.1 材料27-29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法29-30
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-34
• 第二部分 伯氏疏螺旋體重組膜蛋白A(rBmPA)對(duì)昆明小鼠體內(nèi)作用的研究34-59
• 1、萊姆關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型建立34-37
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物34
• 1.2 主要儀器34-36
• 1.3 實(shí)驗(yàn)溶液配置36
• 1.4 小鼠模型的建立36-37
• 2、萊姆關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中rBmpA刺激白細(xì)胞介素-17的變化研究37-42
• 2.1 主要儀器37-38
• 2.2 主要溶液試劑配制38
• 2.3 樣本收集38
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理38
• 2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-42
• 3、rBmpA刺激小鼠萊姆關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生趨化因子的蛋白芯片檢測(cè)42-48
• 3.1 主要儀器43-45
• 3.2 主要溶液試劑配制45
• 3.3 樣本收集45
• 3.4 蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)rBmpA刺激小鼠萊姆關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生趨化因子結(jié)果45-48
• 4、rBmpA刺激小鼠萊姆關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生趨化因子的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)48-59
• 4.1 主要儀器49-51
• 4.2 主要溶液試劑配制51
• 4.3 樣本收集51
• 4.4 實(shí)驗(yàn)方法51-52
• 4.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理52
• 4.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-59
• 全文討論59-63
• 參考文獻(xiàn)63-71
• 綜述71-80
• 參考文獻(xiàn)76-80
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況80-81
• 致謝81

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