本文關鍵詞：伯氏疏螺旋體重組膜蛋白A對人白血病T淋巴細胞株的體外作用及對昆明小鼠體內作用的研究

  更多相關文章： 關節(jié)萊姆病 rBmpA 人白血病T淋巴細胞Jurkat 細胞因子 趨化因子

【摘要】：研究目的：1.本實驗以人白血病T淋巴細胞株Jurkat細胞為模型,利用蛋白芯片技術、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzymes linked immunosorbent assay,Elisa)及實時定量RT-PCR技術,研究伯氏疏螺旋體重組膜蛋白A (recombinant Borrelia burgdorferi membrane protein A,rBmpA)刺激Jurkat細胞產(chǎn)生細胞因子及刺激昆明小鼠關節(jié)產(chǎn)生趨化因子的作用,以探索rBmpA與萊姆關節(jié)炎發(fā)病的關系。2.以人白血病T淋巴細胞株Jurkat細胞為模型,用ELISA方法檢測經(jīng)rBmpA刺激后Jurkat細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子：白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、白介素-17A (IL-17A)及腫瘤壞死因子TNF-a,從細胞水平探討rBmpA致萊姆關節(jié)炎的作用機制。3.以伯氏疏螺旋體重組膜蛋白A (recombinant Borrelia burgdorferi membrane protein A,rBmpA)刺激昆明小鼠關節(jié)造模,參照高通量抗體蛋白芯片篩選結果,采用RT-PCR方法檢測經(jīng)rBmpA刺激后小鼠關節(jié)及血中趨化因子：(MIP-1 α/CCL3)及(SDF-1 α/CXCL12)的表達水平,從基因水平探討rBmpA致萊姆關節(jié)炎的作用機制。研究方法：1、24孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)Jurkat細胞[培養(yǎng)基為5%RPMI-1640培養(yǎng)基,細胞濃度5×105/mL,體積1ml],培養(yǎng)6-12小時后,待細胞適應后,用100μg/mL植物血凝素PHA及80μg/mL rBmpA分別處理Jurkat細胞,在作用12小時、24小時后收集細胞培養(yǎng)上清液。2、用ELISA法檢測細胞上清液中細胞因子(IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A、TNF-α)的表達量。3、將昆明小鼠隨機分為三組：實驗組(0.005mg/ml)、對照組(0.01M PBS)、空白組(不予任何處理),左右腿均50ul,7天、14天分批處理,分別收集小鼠關節(jié)液及眼角血液,參照高通量抗體蛋白芯片篩選結果,采用RT-PCR法分別檢測關節(jié)液及眼部血液中趨化因子(MIP-1 α/CCL3)及(SDF-1 α/CXCL12)基因mRNA的表達水平。4、設計特異性引物擴增目的基因(MIP-1 α/CCL3)及(SDF-1α/CXCL12)和內參基因(GAPDH),將RNA反轉錄為cDNA,運用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測趨化因子(MIP-1 α/CCL3)及(SDF-1 α/CXCL12)mRNA轉錄水平,利用計算相對表達量法進行相對定量分析,應用統(tǒng)計軟件對其進行統(tǒng)計學分析。研究結果：1、本次研究成功探索出人白血病T淋巴細胞株(jurkat細胞)體外培養(yǎng)條件、方法及注意事項。2、本次研究用rBmpA刺激昆明小鼠關節(jié)造模,成功建立了小鼠萊姆關節(jié)炎模型。3、ELISA結果顯示：80 μ g/mL的rBmpA和100 μ g/mL的PHA都可以誘導人白血病T淋巴細胞株(jurkat細胞)活化分泌釋放細胞因子IL-4和IL-17A,差異有統(tǒng)計學意義。4、用ELISA法分別檢測rBmpA刺激小鼠萊姆關節(jié)炎的動物模型試驗的小鼠血清上清液及關節(jié)勻漿液的IL-17含量,結果表明：實驗組(rBmpA組)IL-17含量明顯高于對照組(PBS組)和空白組,差異有統(tǒng)計學意義,p0.05。5、通過蛋白芯片技術對25種小鼠趨化因子進行檢測,成功篩選出CCL3和CXCL16兩個趨化因子做后續(xù)的研究。6、小鼠血清上清液和關節(jié)勻漿液趨化因子CCL3 mRNA實時熒光定量PCR檢測結果均表明：7d后和14d后,實驗組(rBmpA組),對照組(PBS組),空白組三組之間CCL3基因mRNA相對表達量之間存在差異,rBmpA組CCL3基因mRNA相對表達量均高于實驗組和對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。7、小鼠關節(jié)勻漿液趨化因子CXCL16 mRNA實時熒光定量PCR檢測結果也表明,實驗組(rBmpA組),對照組(PBS組),空白組三組之間CXCL16基因mRNA相對表達量之間存在差異,rBmpA組CXCL16基因mRNA相對表達量均高于實驗組和對照組,差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結論：1、本次研究成功探索出人白血病T淋巴細胞株(jurkat細胞)體外培養(yǎng)方法,同時成功建立了小鼠萊姆關節(jié)炎動物模型。2、體外研究(rBmpA刺激人類白血病T淋巴細胞株(Jurkat細胞)誘導其活化分泌釋放細胞因子IL-4和IL-17A)和體內研究(萊姆關節(jié)炎動物模型中rBmpA刺激炎性因子IL-17, CCL3, CXCL16的變化)都證明了：rBmpA與萊姆關節(jié)炎的發(fā)生機制有關,同時也說明細胞因子、趨化因子與萊姆病關節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關。
【關鍵詞】：關節(jié)萊姆病 rBmpA 人白血病T淋巴細胞Jurkat 細胞因子 趨化因子
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R514
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 相關縮略詞12-14
• 引言14-20
• 1.1 萊姆病臨床癥狀及診斷14-15
• 1.2 伯氏疏螺旋體及伯氏疏螺旋體膜蛋白A(BmpA)15-17
• 1.3 萊姆病關節(jié)炎致病機理17-19
• 1.4 實驗目的及意義19-20
• 第一部分 伯氏疏螺旋體重組膜蛋白A(rBmPA)對人白血病T淋巴細胞株的體外作用20-34
• 1、人白血病T淋巴細胞株(jurkat細胞)體外培養(yǎng)方法20-26
• 1.1 實驗材料及主要溶液20-23
• 1.2 實驗方法23-24
• 1.3 實驗結果24-26
• 2、酶聯(lián)免疫吸附試驗(Elisa)檢測rBmpA刺激小人白血病T淋巴細胞株(jurkat細胞)產(chǎn)生細胞因子的影響26-34
• 2.1 材料27-29
• 2.2 實驗方法29-30
• 2.3 實驗結果30-34
• 第二部分 伯氏疏螺旋體重組膜蛋白A(rBmPA)對昆明小鼠體內作用的研究34-59
• 1、萊姆關節(jié)炎動物模型建立34-37
• 1.1 實驗動物34
• 1.2 主要儀器34-36
• 1.3 實驗溶液配置36
• 1.4 小鼠模型的建立36-37
• 2、萊姆關節(jié)炎動物模型中rBmpA刺激白細胞介素-17的變化研究37-42
• 2.1 主要儀器37-38
• 2.2 主要溶液試劑配制38
• 2.3 樣本收集38
• 2.4 統(tǒng)計學處理38
• 2.5 實驗結果38-42
• 3、rBmpA刺激小鼠萊姆關節(jié)炎產(chǎn)生趨化因子的蛋白芯片檢測42-48
• 3.1 主要儀器43-45
• 3.2 主要溶液試劑配制45
• 3.3 樣本收集45
• 3.4 蛋白芯片技術檢測rBmpA刺激小鼠萊姆關節(jié)炎產(chǎn)生趨化因子結果45-48
• 4、rBmpA刺激小鼠萊姆關節(jié)炎產(chǎn)生趨化因子的實時熒光定量PCR方法檢測48-59
• 4.1 主要儀器49-51
• 4.2 主要溶液試劑配制51
• 4.3 樣本收集51
• 4.4 實驗方法51-52
• 4.5 統(tǒng)計學處理52
• 4.6 實驗結果52-59
• 全文討論59-63
• 參考文獻63-71
• 綜述71-80
• 參考文獻76-80
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況80-81
• 致謝81

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本文編號：888836