本文關(guān)鍵詞：基于qRT-PCR建立評價Ⅱ型登革病毒抗體中和效應(yīng)的微量中和試驗方法

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【摘要】：登革病毒(Dengue virus,DENV)是熱帶與亞熱帶地區(qū)發(fā)病最多、危害最大的蟲媒病毒,DENV感染一般可引起登革熱(Dengue fever,DF),嚴(yán)重的還能引起登革出血熱(dengue haemorrhagic fever,DHF)、甚至是死亡率極高的登革休克綜合征(dengue shock syndrome,DSS)。目前正在研制中的DENV疫苗種類較多,但僅有賽諾菲公司生產(chǎn)的四價疫苗于2015年12月才在墨西哥獲得批準(zhǔn)。如何準(zhǔn)確、高效地測定和評價疫苗刺激產(chǎn)生的抗體的中和效應(yīng)一直是DENV疫苗研制的難題之一。傳統(tǒng)的測定中和抗體效價的方法是中和試驗(Neutralization Test,NT),其中空斑減少中和試驗(Plaque Reduction Neutralization Test,PRNT)一直被譽(yù)為“金標(biāo)準(zhǔn)”,但其操作繁瑣、耗時長、通量低。而微量中和試驗(Micro-neutralization Test,MN)的基本原理與PRNT相同,優(yōu)點(diǎn)在于試劑用量少、通量高。目前基于Taq Man探針的實(shí)時定量PCR(q RT-PCR)具有高特異性、高敏感性和易于高通量檢測等諸多優(yōu)勢,已被廣泛用于病毒核酸的定量檢測。近年來,多項研究表明基于q RT-PCR建立的MN方法可有效地應(yīng)用于測定病毒中和抗體效價,譬如在流感病毒、CMV和SV40的中和抗體效價測定方面已經(jīng)成功建立了q RT-PCR-MN方法。本研究以DENV2為研究對象,首先建立了基于一步法Taq Man探針q RT-PCR檢測DENV2 RNA的方法并進(jìn)行優(yōu)化,然后在此基礎(chǔ)上建立了測定DENV2中和抗體效價的q RT-PCR-MN方法,并進(jìn)行了一系列條件優(yōu)化�！狙芯糠椒敖Y(jié)果】一、一步法Taq Man探針q RT-PCR檢測DENV2 RNA的建立及優(yōu)化首先培養(yǎng)DENV2的易感細(xì)胞C6/36,按MOI=0.1接種細(xì)胞進(jìn)行病毒大量增殖,獲得的病毒經(jīng)濃縮后保存于-80℃?zhèn)溆�。然后分別用空斑實(shí)驗、TCID50檢測、免疫熒光實(shí)驗對DENV2毒力進(jìn)行測定,病毒滴度分別為2×106 PFU/m L、2.53×105TCID50/m L。針對DENV2保守區(qū)域NS5基因,分別設(shè)計并合成引物和探針,PCR擴(kuò)增得到目的片段并制備RNA標(biāo)準(zhǔn)品,經(jīng)核酸電泳驗證均與預(yù)期大小一致。將標(biāo)準(zhǔn)品10倍系列稀釋作為模板,進(jìn)行一步法Taq Man探針q RT-PCR,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)一步探索PCR反應(yīng)體系中引物與探針的最佳配比。結(jié)果顯示,q RT-PCR方法檢測DENV2 RNA的線性范圍為1.0×102~108 copies/μl。與空斑實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行比較,1PFU對應(yīng)大約7500 copies。計算出q RT-PCR方法檢測DENV2的靈敏度為0.013PFU,大約是空斑實(shí)驗的75倍。二、檢測DENV2抗體中和效應(yīng)的q RT-PCR-MN方法的建立在上述實(shí)驗的基礎(chǔ)上,通過q RT-PCR方法測定系列稀釋病毒感染BHK-21細(xì)胞后上清中的病毒量隨時間的動態(tài)變化,確定最佳感染劑量為2000 TCID50和最佳檢測時間為感染后24小時。然后兩倍系列稀釋病毒感染BHK-21細(xì)胞24小時后,q RT-PCR方法同時檢測細(xì)胞上清(未提取RNA)和細(xì)胞內(nèi)(提取RNA)的病毒量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外病毒量呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=0.998,而且感染細(xì)胞上清中病毒量與感染劑量呈正相關(guān),r=0.982。以上結(jié)果證明了直接以感染細(xì)胞上清作為PCR檢測樣品的可行性,q RT-PCR方法可以至少辨別兩倍病毒感染劑量的變化。在此基礎(chǔ)上,建立了測定DENV2中和抗體效價的q RT-PCR-MN方法。以35份血清為研究對象時,分別用PRNT和q RT-PCR-MN方法測定抗體的中和效應(yīng),兩者相關(guān)系數(shù)r=0.928;再以抗DENV2的單克隆抗體4G2為研究對象時,結(jié)果顯示PRNT(IC50)為0.17μg/m L,q RT-PCR-MN(IC50)為0.10μg/m L,兩者相關(guān)系數(shù)r=0.944。以PRNT為對照,分析35份血清的檢測結(jié)果,q RT-PCR-MN的靈敏度為100%(7/7,95%CI:0.59 1.00),特異性為96.43%(27/28,95%CI:0.82 1.00),Kappa系數(shù)為0.915,說明一致性較好。最后,我們在三臺不同品牌實(shí)時定量PCR儀上用q RT-PCR-MN方法同時檢測10份血清的中和效價,結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異,這說明建立的q RT-PCR-MN方法在不同儀器上具有較好的可比性,有利于各實(shí)驗室之間結(jié)果的互認(rèn)�！窘Y(jié)論】本研究成功建立了以q RT-PCR為基礎(chǔ)的測定DENV2中和抗體效價的微量中和試驗方法。以經(jīng)典PRNT為參照,該方法靈敏度、特異性、一致性評價均較好。本方法中以上清液直接作為PCR檢測樣品,簡便快捷,而且便于自動化檢測。不同儀器之間的檢測結(jié)果具有較好的可比性,有利于在臨床實(shí)驗室推廣。本研究不僅適用于快速有效地檢測和評價DENV疫苗刺激產(chǎn)生的中和抗體效價,也適用于DENV爆發(fā)流行時的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查研究。
【關(guān)鍵詞】：登革病毒 微量中和試驗 qRT-PCR
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R512.8;R446.6
【目錄】：

• 縮略語表5-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-30
• 第一部分 一步法TaqMan探針qRT-PCR檢測DENV2方法的建立及優(yōu)化30-46
• 1 材料30-33
• 1.1 毒種和細(xì)胞株30
• 1.2 主要試劑30-31
• 1.3 常用培養(yǎng)液（基）與緩沖液31-32
• 1.4 主要儀器與器材32-33
• 2 方法33-40
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)33
• 2.2 病毒的增殖與毒力檢測33-35
• 2.3 引物設(shè)計與合成35-36
• 2.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備36-38
• 2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線38-40
• 3 結(jié)果40-44
• 3.1 濃縮DENV2毒力檢測40-41
• 3.2 DENV2 NS5基因片段的PCR擴(kuò)增41-44
• 4 討論44-46
• 第二部分 檢測DENV2抗體中和效應(yīng)的qRT-PCR-MN方法的建立46-59
• 1 材料46-47
• 1.1 毒種和細(xì)胞株46
• 1.2 主要試劑與抗體46
• 1.3 常用培養(yǎng)液（基）與緩沖液46-47
• 1.4 主要儀器與器材47
• 2 方法47-50
• 2.1 引物、探針設(shè)計與合成47
• 2.2 空斑減少中和試驗47-48
• 2.3 qRT-PCR-MN測定48-49
• 2.4 提取DENV2感染細(xì)胞內(nèi)總RNA49-50
• 2.5 不同的實(shí)時定量PCR儀比對50
• 3 結(jié)果50-56
• 3.1 最佳病毒感染劑量和感染后檢測時間的確定50-51
• 3.2 感染后細(xì)胞內(nèi)外病毒量的相關(guān)性51
• 3.3 qRT-PCR方法可以辨別病毒感染劑量兩倍的變化51-52
• 3.4 PRNT與qRT-PCR-MN相關(guān)性分析52-54
• 3.5 qRT-PCR-MN方法的特異性、靈敏度和一致性分析結(jié)果54-55
• 3.6 qRT-PCR-MN方法在不同實(shí)時定量PCR儀上一致性的分析55-56
• 4 討論56-59
• 小結(jié)59-60
• 參考文獻(xiàn)60-73
• 個人簡歷和研究成果73-74
• 致謝74-75

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳正青;高純;;應(yīng)用中和試驗對乙型肝炎病毒表面抗原弱反應(yīng)性標(biāo)本確認(rèn)的臨床意義[J];實(shí)用醫(yī)技雜志;2012年07期

2 劉大英;;用敏感的中和試驗檢測抗HIV抗體陽性率[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;1989年02期

3 鄭官增,姚蘋蘋,朱函平,朱智勇;水痘帶狀皰疹病毒蝕斑減少中和試驗[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2001年05期

4 馬文煜,田喜燕,姜紹諄,王安定,汪美先;用微量細(xì)胞培養(yǎng)中和試驗檢測乙型腦炎病毒抗體的探討[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1984年02期

5 安獻(xiàn)祿,李新發(fā),于文彬;酶聯(lián)免疫吸附試驗與中和試驗檢測Ⅰ型單純皰疹病毒抗體的比較[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;1983年03期

6 邵文愛,李曉眠;微量細(xì)胞中和試驗在檢測流行性乙型腦炎抗體中的應(yīng)用[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2003年03期

7 郭中平;小鼠中和試驗與快速熒光灶抑制試驗檢測狂犬病抗體結(jié)果的比較[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;1986年03期

8 張曉春,蔡軍,王玉芹,王杰;中和試驗法對健康人群麻疹抗體水平的檢測及評價[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2001年06期

9 楊英珍,金佩英,郭棋;用微量板中和試驗細(xì)胞病變自動定量讀數(shù)法檢測血清中柯薩奇B組病毒抗體[J];上海第一醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1985年03期

10 ;復(fù)方“乙腦”注射液對腦炎病毒的中和試驗[J];新醫(yī)藥通訊;1971年02期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 滕龍;傅圣勇;;HbsAg與HbsAb中和比的初步研究[A];2004年浙江省檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 北京獸藥研究所 中青;裂谷熱診斷技術(shù)[N];中國畜牧水產(chǎn)報;2001年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 翁代慧;基于qRT-PCR建立評價Ⅱ型登革病毒抗體中和效應(yīng)的微量中和試驗方法[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

2 金悅新;檢測豬乙腦抗體的EDⅢ抗原間接ELISA與血凝抑制和蝕斑減少中和試驗的相關(guān)性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

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本文編號：871889