本文關(guān)鍵詞：小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞與新生隱球菌GXM作用后基因表達(dá)譜分析

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【摘要】：研究背景全球每年有高達(dá)100萬隱球菌性腦膜腦炎(簡稱隱腦)新發(fā)病例,每年有接近62萬人死于本病,隱球菌病日益受到人們的重視。隱球菌區(qū)別于其他重要醫(yī)學(xué)真菌的特征是具有多糖莢膜,傳統(tǒng)認(rèn)為其胞外多糖組分分為三種：葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖(glucuronoxylomannan,GXM)、半乳糖木糖甘露聚糖(galactoxylomannan, GalXM)和甘露糖蛋白(mannoprotein,MP)。近年來,應(yīng)用血清學(xué)技術(shù)、磁共振技術(shù)和糖組分分析,對隱球菌莢膜的了解逐步加深,不同菌株間GXM的差異致使抗原性的不同,目前基于此新生隱球菌劃分為5種血清型——A、B、C、D和AD型。GXM是隱球菌莢膜多糖最主要的成分,約占莢膜總質(zhì)量的88%。一般認(rèn)為莢膜多糖的毒性作用主要表現(xiàn)在保護菌體抗吞噬作用和影響宿主免疫防御兩方面。雖然體外實驗有較為充分的證據(jù),但對于溶解的多糖和細(xì)胞附屬的多糖哪個更具毒性等問題并不清楚。隱球菌病的突出特點在于具有強烈的嗜中樞性,其中九成以上播散性隱球菌感染侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng),但這一特征的分子機制目前仍不清楚。一直以來,隱球菌如何通過血-腦脊液屏障的分子機制都是研究者們關(guān)注的熱點和研究的難點。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞三者共同組成血-腦脊液屏障,組成的緊密連接網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),能夠有效隔離開血液和腦脊液,嚴(yán)格調(diào)控兩者間物質(zhì)交換。其中,腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞是維持血-腦脊液屏障功能最重要的細(xì)胞；與周圍組織內(nèi)皮細(xì)胞間不同點在于,腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞具極低胞吞能力、表達(dá)特異肽轉(zhuǎn)運蛋白和離子,毗鄰的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間形成豐富的緊密連接,形成有效的物理屏障,顯著降低了小分子物質(zhì)的通透。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)隱球菌菌體與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用,能夠引起腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能改變,可能與隱球菌穿透血腦屏障相關(guān)。本研究就莢膜最主要成分GXM對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響進(jìn)行初步的探索。研究目的探索新生隱球菌GXM能否影響腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞基因的表達(dá),為進(jìn)一步挖掘隱球菌嗜中樞性的分子機制提供線索、奠定基礎(chǔ)。研究方法第一部分使用Roche NimbleGen 12 x 135K小鼠基因表達(dá)譜芯片篩選小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系bEnd.3與不同濃度新生隱球菌GXM作用后差異表達(dá)的基因；結(jié)合基因本體論(GO,Gene Ontology),使用標(biāo)準(zhǔn)富集法對差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO分析,進(jìn)行GO項top10排序,推斷所篩選差異基因的功能；結(jié)合GO語義,篩選與隱球菌侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)能力相關(guān)的差異表達(dá)基因的信息。第二部分對篩選出的重要基因PIK3C2G和ADAMDEC1,采用熒光實時定量PCR對其變化加以驗證。結(jié)果第一部分我們對bEnd.3細(xì)胞與新生隱球菌GXM作用前后基因表達(dá)進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn),實驗組(GXM (90μg/ml)組總共有402個基因表達(dá)上調(diào),296個基因表達(dá)下調(diào),GXM (180μg/ml)組總共有421個基因表達(dá)上調(diào),564個基因表達(dá)下調(diào)。GO項目top10排序提示,新生隱球菌GXM能夠調(diào)節(jié)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá),細(xì)胞緊密連接、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜成分相關(guān)代謝等GO條目變化顯著。第二部分PIK3C2G基因和ADAMDECl基因進(jìn)行熒光定量PCR驗證,結(jié)果與芯片結(jié)果一致,基因表達(dá)水平不同程度上升,且與GXM濃度正相關(guān)。結(jié)論新生隱球菌GXM可以影響腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞基因的表達(dá),PIK3C2G基因、ADAMDECl基因表達(dá)水平上調(diào)可能和隱球菌侵襲血腦屏障能力有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 新生隱球菌 GXM 基因芯片
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R519.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 縮略詞表9-10
• 前言10-14
• 第一部分 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系BEND.3與新生隱球菌GXM作用后基因表達(dá)譜分析14-49
• 一、主要材料和設(shè)備14-16
• 二、實驗方法與步驟16-24
• 三、實驗結(jié)果24-47
• 四、討論47-49
• 第二部分 小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系BEND.3與新生隱球菌GXM作用后PIK3C2G基因與ADAMDEC1基因表達(dá)水平的改變49-60
• 一、主要材料和設(shè)備49-51
• 二、實驗方法與步驟51-54
• 三、實驗結(jié)果54-58
• 四、討論58-60
• 論文小結(jié)60-61
• References61-64
• 綜述：隱球菌病免疫治療的研究進(jìn)展64-71
• References68-71
• 在讀期間參加科研工作及學(xué)術(shù)會議情況71-72
• 致謝72

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