本文關(guān)鍵詞：allo-HSCT后EBV感染的危險(xiǎn)因素分析及CTL治療的研究

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【摘要】：由于造血干細(xì)胞移植過(guò)程中預(yù)處理方案對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的破壞,以及移植后免疫抑制劑的使用,導(dǎo)致機(jī)體在移植后免疫功能恢復(fù)緩慢,感染成為移植后非復(fù)發(fā)死亡的重要原因。在眾多感染病原體中,EB病毒(EBV)是常見(jiàn)的病毒感染之一。EBV在人群中的感染率在90%以上,正常人的感染大多表現(xiàn)為潛伏感染的形式。但是移植后機(jī)體免疫系統(tǒng)失去了對(duì)EBV的監(jiān)視,導(dǎo)致EBV再激活,引起病毒血癥、肺炎、腦炎以及移植后淋巴細(xì)胞增殖性疾病(PTLD)等并發(fā)癥。尤其是PTLD,雖然該病發(fā)病率低,但進(jìn)展迅速,死亡率高,嚴(yán)重影響患者長(zhǎng)期生存。目前對(duì)于移植后EBV的感染尚缺乏有效的治療措施,細(xì)胞免疫治療作為一種新型治療方式,能夠幫助機(jī)體建立抗病毒免疫,有效率高且毒副作用少,是治療移植后EBV感染的新途徑,具有很好的臨床應(yīng)用前景。目的:本研究的目的就是通過(guò)研究移植后發(fā)生EBV感染的人群,分析高危因素及預(yù)后特征,并應(yīng)用體外制備的病毒特異性T淋巴細(xì)胞(CTL)來(lái)治療移植后EBV感染的患者,研究該方法的安全性和有效性,為臨床防治移植后EBV感染提供新思路。內(nèi)容:本文的研究?jī)?nèi)容主要分三個(gè)方面。1.對(duì)我中心行造血干細(xì)胞移植的病例進(jìn)行回顧性分析,對(duì)發(fā)生EBV感染人群的特征進(jìn)行研究,統(tǒng)計(jì)患者年齡、預(yù)處理方案、移植類型、HLA相合程度、GVHD的發(fā)生情況等信息,分析EBV血癥及PTLD的發(fā)生率,找出高危因素,并對(duì)感染者的預(yù)后特征加以分析。2.采用EBV特異性多肽負(fù)載的方法,由G-CSF動(dòng)員后的供者干細(xì)胞采集物作為細(xì)胞來(lái)源,體外制備病毒特異性CTL(G-CTL),對(duì)其表型、功能進(jìn)行檢測(cè),并與未動(dòng)員供者來(lái)源的CTL(N-CTL)進(jìn)行比較。3.對(duì)移植后發(fā)生EBV感染的患者進(jìn)行治療性輸注,評(píng)價(jià)安全性及有效性。方法:1.回顧性研究2011年11月至2014年11月在我中心行造血干細(xì)胞移植的402例病例,采用Kaplan-Meier模型分析EB病毒感染的累積發(fā)生率及預(yù)后特征,logistic回歸模型分析危險(xiǎn)因素。2.研究中國(guó)人群HLA基因型的分布頻率,找出HLA-A、HLA-B、HLA-DR位點(diǎn)頻率高的基因型,根據(jù)HLA位點(diǎn)選擇并合成EBV特異性抗原肽庫(kù)。利用動(dòng)員后供者干細(xì)胞采集物作為來(lái)源,密度梯度離心法分離PBMC,分貼壁與非貼壁細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),貼壁細(xì)胞加入IL-4、GMCSF、TNF-α誘導(dǎo)向DC分化,并在第7天負(fù)載EBV特異性抗原肽,而后與非貼壁細(xì)胞混合,加入IL-2擴(kuò)增。第14-21天收獲細(xì)胞。而后,對(duì)收獲的G-CTL細(xì)胞進(jìn)行體外檢測(cè)。測(cè)定DC細(xì)胞表面分子CD11c、CD80、CD86、CD83的表達(dá)情況,檢測(cè)CTL細(xì)胞群中CD3+、CD3-CD56+、CD4+、CD8+細(xì)胞比例,采用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)(ics)檢測(cè)ctl細(xì)胞在受到多肽刺激后胞內(nèi)ifn-γ的分泌情況,采用cba技術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)上清內(nèi)ifn-γ、tnf-α、顆粒酶b的分泌情況。并與采用同樣培養(yǎng)方法得到的n-ctl細(xì)胞進(jìn)行比較。3.選取移植后易發(fā)生ebv再激活的高危患者,利用其動(dòng)員后供者干細(xì)胞采集物提前制備ctl,并進(jìn)行凍存。當(dāng)患者出現(xiàn)ebv血癥時(shí)進(jìn)行治療性輸注,每周輸注1次,根據(jù)制備的ctl細(xì)胞數(shù)及臨床效果決定具體的輸注劑量及輸注頻次。對(duì)于低�；蛭刺崆爸苽鋍tl的患者,用其供者二次采集的非動(dòng)員pbmc制備ctl。輸注后24h內(nèi)密切觀察發(fā)熱、皮疹等輸注相關(guān)不良反應(yīng)時(shí)間的發(fā)生情況,輸注后的3月內(nèi)監(jiān)測(cè)急性gvhd的發(fā)生情況。采用pcr方法連續(xù)監(jiān)測(cè)患者外周血ebv-dna的拷貝數(shù)變化,計(jì)算治療的有效率。結(jié)果:1.共對(duì)402例移植后患者進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析,ebv血癥的1年累積發(fā)生率為42%,中位發(fā)生時(shí)間為移植后50天,83.5%的感染發(fā)生在移植后的100天以內(nèi)。ptld的1年累積發(fā)病率為1.45%,中位發(fā)病時(shí)間為65天。多因素logistic回歸分析表明,發(fā)生ebv血癥的危險(xiǎn)因素為預(yù)處理中使用atg(p0.001,hr9.92)和發(fā)生Ⅲ~Ⅳ°急性移植物抗宿主病(p=0.0016,hr2.42)。具有2個(gè)危險(xiǎn)因素的患者ebv血癥的1年累積發(fā)生率明顯高于沒(méi)有危險(xiǎn)因素的患者(87.5%vs24.6%,p0.001)。發(fā)生ebv血癥患者的3年總生存率明顯低于未發(fā)生eb病毒血癥患者(58.5%vs75.4%,p0.001)。2.(1)共合成89條ebv特異性多肽,所合成的多肽中由大部分hla-Ⅰ類表位多肽和一部分hla-Ⅱ類表位多肽組成,主要針對(duì)ebv-lmp1,lmp2,ebna1,ebna3,bzlf1,brlf1等免疫顯性抗原。經(jīng)驗(yàn)證,此多肽庫(kù)對(duì)hla表位的覆蓋率超過(guò)了90%。(2)經(jīng)過(guò)7天的培養(yǎng),貼壁細(xì)胞呈現(xiàn)典型的dc形態(tài),經(jīng)檢測(cè),cd11c+細(xì)胞比例為97.8%±1.8%,cd80+細(xì)胞比例為68.35%±21.3%,cd86+細(xì)胞比例為90.4%±10.5%,cd83+細(xì)胞比例為13.4%±12.3%。g-ctl收獲時(shí)細(xì)胞總數(shù)平均擴(kuò)增1.7倍,n-ctl平均擴(kuò)增3.1倍,兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。g-ctl中cd3+細(xì)胞比例為84.3%±8.8%,其中cd4+細(xì)胞比例為35.3%±11%,cd8+細(xì)胞比例為51.4%±12.6%,cd3-cd56+細(xì)胞比例為10.9%±6.7%;與n-ctl相比無(wú)明顯差別。(3)g-ctl經(jīng)ebv特異性多肽刺激后,分泌大量顆粒酶b、ifn-γ、tnf-α,分別為5807.8±2926.2pg/ml、450.4±332.9pg/ml、34±32.2pg/ml。ics檢測(cè)表明g-ctl中cd3+ifn-γ+特異性細(xì)胞比例為20.7%±10.5%,其中cd8+ifn-γ+細(xì)胞比例為18.4%±10.6%;而n-ctl中cd3+ifn-γ+、cd8+ifn-γ+細(xì)胞比例分別為28.2%±17.5%、22.5%±17%,較動(dòng)員組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.共8例移植后發(fā)生EBV感染的患者接受了CTL輸注治療,其中7例采用動(dòng)員后供者的干細(xì)胞采集物制備,1例采用供者二次采集的未動(dòng)員PBMC進(jìn)行制備。單次輸注劑量為(2.3~35.1)×105/kg,輸注總劑量為(0.87~7.89)×106/kg,輸注次數(shù)為2~8次。輸注24h內(nèi)未見(jiàn)與細(xì)胞輸注相關(guān)的毒副作用。1例患者發(fā)生腸道重度急性GVHD,可能與輸注劑量的提高及免疫抑制劑的停用有關(guān)。6例患者外周血EBV-DNA拷貝數(shù)明顯下降,達(dá)到CR,2例患者無(wú)效,總有效率為75%。結(jié)論:首先,本研究對(duì)我中心造血干細(xì)胞移植后EBV感染的危險(xiǎn)因素及預(yù)后特征進(jìn)行了分析,移植后EBV感染的發(fā)生率較高,影響患者長(zhǎng)期生存,使用ATG與發(fā)生重度急性GVHD是發(fā)生EBV血癥的危險(xiǎn)因素。然后,我們合成了中國(guó)人群HLA特異性EBV抗原肽庫(kù),驗(yàn)證了其較廣的覆蓋率,適用于中國(guó)人群。并利用動(dòng)員后供者的干細(xì)胞采集物成功制備了EBV-CTL,雖然其擴(kuò)增能力不及未動(dòng)員供者來(lái)源的CTL,但在細(xì)胞表型與功能上兩者無(wú)明顯差異。最后,我們用CTL治療了8例患者,顯示出了良好的臨床療效。除1例發(fā)生急性GVHD外,未見(jiàn)其他毒副作用。采用動(dòng)員后供者來(lái)源的CTL治療移植后EBV再激活的有效率較高,便于臨床應(yīng)用。在治療過(guò)程中,應(yīng)注意針對(duì)不同個(gè)體,確定安全的輸注劑量,以減少急性GVHD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。
【關(guān)鍵詞】：EB病毒 造血干細(xì)胞移植 危險(xiǎn)因素 粒細(xì)胞集落刺激因子 細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R457.7;R511
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-14
• 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)14-15
• 第一部分 allo-HSCT后EBV感染的危險(xiǎn)因素及預(yù)后分析15-22
• 對(duì)象與方法15-18
• 結(jié)果18-20
• 討論20-22
• 第二部分 EBV特異性CTL的制備及體外功能研究22-31
• 材料與方法22-26
• 結(jié)果26-29
• 討論29-31
• 第三部分 EBV特異性CTL治療HSCT后EBV感染的臨床研究31-39
• 對(duì)象與方法31-33
• 結(jié)果33-36
• 討論36-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-47
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷47-48
• 致謝48

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