本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白超家族及其在尾蚴入侵階段應(yīng)激反應(yīng)的初步分析研究

  更多相關(guān)文章： 日本血吸蟲(chóng) 熱休克蛋白 致弱尾蚴 表達(dá)譜 熱休克因子 可變剪切

【摘要】：自古以來(lái),血吸蟲(chóng)病作為一種經(jīng)疫水傳播的疾病不斷地危害人類(lèi)的健康,它的病原生物血吸蟲(chóng)有著特殊的傳播過(guò)程和感染過(guò)程,在血吸蟲(chóng)的生活史中,螺和哺乳動(dòng)物分別是它的中間宿主和終宿主,在血吸蟲(chóng)感染宿主及在宿主體內(nèi)發(fā)育繁殖的過(guò)程中,血吸蟲(chóng)需要具備識(shí)別,入侵,抗應(yīng)激的能力。血吸蟲(chóng)是多細(xì)胞的動(dòng)物,隸屬于吸蟲(chóng),雌雄異體,寄生生活。在寄生過(guò)程中,宿主可以產(chǎn)生對(duì)蟲(chóng)體的抵抗作用。研究表明,在流行區(qū)人群對(duì)血吸蟲(chóng)具有一定的免疫保護(hù)力；東方田鼠可以對(duì)血吸蟲(chóng)完全抵抗；易感動(dòng)物對(duì)致弱尾蚴免疫感染后可產(chǎn)生對(duì)再次感染的抵抗作用。宿主的免疫對(duì)于血吸蟲(chóng)生存是一個(gè)挑戰(zhàn)。血吸蟲(chóng)的抗應(yīng)激與宿主的免疫攻擊是研究不同結(jié)局的重要因素,對(duì)于這方面的闡述和研究將有助于更深入的了解宿主與血吸蟲(chóng)的相互關(guān)系。一日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白及其在正常尾蚴和致弱尾蚴的表達(dá)差異目的致弱尾蚴初次免疫小鼠后能夠產(chǎn)生對(duì)于再次感染的抵抗能力,這跟致弱尾蚴經(jīng)紫外線(xiàn)照射后某些分子或者結(jié)構(gòu)的變化可能有關(guān)系,熱休克蛋白在血吸蟲(chóng)的自我防御中發(fā)揮著重要的作用。本章節(jié)研究血吸蟲(chóng)的熱休克蛋白系統(tǒng),同時(shí)研究熱休克蛋白在正常尾蚴和致弱尾蚴當(dāng)中表達(dá)量的改變,以期能夠探索致弱尾蚴免疫效果的機(jī)制。方法1、通過(guò)搜索KEGG數(shù)據(jù)庫(kù),找出HSPs參與的主要的生物學(xué)通路和生物學(xué)過(guò)程；2、在日本血吸蟲(chóng)中,充分挖掘NCBI當(dāng)中日本血吸蟲(chóng)的熱休克蛋白的基因序列；3、依據(jù)是按照分子量的大小,序列的結(jié)構(gòu)域分析及細(xì)胞的不同部位對(duì)日本血吸蟲(chóng)的熱休克蛋白進(jìn)行分類(lèi)；用MEGA軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建,用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對(duì),比較熱休克蛋白的分子進(jìn)化,比較日本血吸蟲(chóng),曼氏血吸蟲(chóng),秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng),小鼠和人之間熱休克蛋白的同源關(guān)系；4、通過(guò)特定的紫外光的照射,構(gòu)建日本血吸蟲(chóng)致弱尾蚴的模型,分別用正常尾蚴和致弱尾蚴感染小鼠皮膚,在兩個(gè)不同的時(shí)間(感染后1小時(shí)和感染后2.5小時(shí))取下皮膚,用感染了血吸蟲(chóng)的小鼠皮膚來(lái)進(jìn)行RNA的提取和后續(xù)的實(shí)驗(yàn)；5、按照熱休克蛋白的家族分類(lèi)和它們分布的不同細(xì)胞部位,挑選了十二個(gè)重要的熱休克蛋白及熱休克因子,用qPCR來(lái)觀察它們?cè)谡Ｎ豺矢腥拘∈笃つw和致弱尾蚴感染小鼠皮膚后表達(dá)量的變化；6、制備血吸蟲(chóng)感染皮膚樣本的石蠟切片,HE染色觀察皮膚期童蟲(chóng)在正常和致弱組中形態(tài)的變化,進(jìn)一步用間接免疫熒光技術(shù)看SjP40在尾蚴當(dāng)中的表達(dá)和定位情況；7、統(tǒng)計(jì)學(xué)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1、生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲(chóng)有著眾多的熱休克蛋白,這些熱休克蛋白可以分為HSP70家族,HSP90家族,HSP40家族,小熱休克蛋白家族,HSP60和HSP10；家族內(nèi)部有分布在不同細(xì)胞部位的熱休克蛋白分子。同時(shí)日本血吸蟲(chóng)也有HSF。2、熱休克蛋白70家族根據(jù)結(jié)構(gòu)域、功能及細(xì)胞定位的不同,可以分為HSPA5、 HSPA8、HSPA9及HSP110；熱休克蛋白90家族根據(jù)結(jié)構(gòu)域、功能及細(xì)胞定位的不同可以分為HSP83, Gp96和TRAP。3、日本血吸蟲(chóng)的熱休克蛋白跟曼氏血吸蟲(chóng)的熱休克蛋白同源性比較接近,其次是宿主小鼠和人,最后是秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)。4、正常尾蚴和致弱尾蚴入侵小鼠皮膚后熱休克蛋白都會(huì)升高,但是致弱尾蚴升高的幅度比正常尾蚴的要小,特別是在基礎(chǔ)表達(dá)量高的基因如HSPA8, P40和HSP90中,它們之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5、致弱尾蚴經(jīng)過(guò)紫外線(xiàn)照射后,蟲(chóng)體的形態(tài)有所改變。結(jié)論1、日本血吸蟲(chóng)擁有完整的熱休克蛋白體系,它們分布于不同部位,有著不同的功能,能夠通過(guò)相互作用組成一個(gè)應(yīng)激的整體,發(fā)揮著蛋白轉(zhuǎn)運(yùn),折疊,修復(fù),降解的功能,這是日本血吸蟲(chóng)抵抗外界刺激和宿主攻擊的基礎(chǔ)。2、正常尾蚴和致弱尾蚴在熱休克蛋白的表達(dá)上,兩者在入侵小鼠皮膚時(shí)都會(huì)升高,但致弱尾蚴升高的幅度沒(méi)有正常的大,這可能會(huì)影響到熱休克蛋白的防御應(yīng)激反應(yīng)。二日本血吸蟲(chóng)熱休克因子基因結(jié)構(gòu)特征及其可變剪切亞型分析研究目的熱休克因子作為經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)結(jié)合熱休克蛋白上游的熱休克原件進(jìn)而調(diào)控?zé)嵝菘朔磻?yīng)。但是日本血吸蟲(chóng)的熱休克因子沒(méi)有報(bào)道,本章首次進(jìn)行日本血吸蟲(chóng)熱休克因子的克隆,鑒定,并分析其基因結(jié)構(gòu)特征和可變剪切亞型。為研究熱休克因子及其調(diào)控提供基礎(chǔ)。方法1、日本血吸蟲(chóng)尾蚴感染新西蘭白兔,42dpi灌注法收集雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)及感染兔肝臟,Trizol法提取總RNA；2、自日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)、蟲(chóng)卵總RNA RT-PCR擴(kuò)增以獲得Sj-hsf ORF全長(zhǎng)片段和Sj-hsf可變剪切區(qū)域片段,進(jìn)行克隆、酶切及測(cè)序鑒定；3、用DNAMAN8.0、InterPrco、Mega6結(jié)合日本血吸蟲(chóng)和曼氏血吸蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)以及GenBank等網(wǎng)絡(luò)分析平臺(tái),深入分析Sj-hsf的基因結(jié)構(gòu)特征、可變剪切模式,與不同物種HSF序列的同源性、功能結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化樹(shù)結(jié)果1、自雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)、蟲(chóng)卵擴(kuò)增、克隆獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒,其中含Sj-hsf ORF的pBSjHSFf-F、pBSjHSFf-M、pBSjHSFf-E以及含可變剪切片段的pBSjHSFs-F、 pBSjHSFs-N、pBSjHSFs-E,酶切及測(cè)序鑒定正確；2、序列分析呈示Sj-hsf具有三種剪切亞型Sj-hsf-isoform1 (2050bp)、 Sj-hsf-isoform2(2086bp)、Sj-hsf-isoform3(2111bp), GenBank登陸號(hào)分別為KU954546、KX119143、KX119144,均位于日本血吸蟲(chóng)基因組SJC-S000780,有8個(gè)外顯子,在雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)和蟲(chóng)卵階段三種亞型均存在,以Sj-hsf-isoform1表達(dá)量高；3、Sj-HSF-isoforml (671aa)、Sj-HSF-isoform2(683aa)具有HSF特征性DBD(DNA Binding Domain)、HR-A/B和HR-C結(jié)構(gòu)域,Sj-HSF-isoform3(282aa)提前終止,無(wú)HR-C結(jié)構(gòu)域；4、進(jìn)化樹(shù)分析表明Sj-HSF三種剪切亞型隸屬HSF1家族,與曼氏血吸蟲(chóng)HSF近源。結(jié)論1、日本血吸蟲(chóng)雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)、蟲(chóng)卵階段均存在三種剪切亞型的HSF,以Sj-HSF-isoforml表達(dá)量高。2、Sj-HSF三種剪切亞型隸屬HSF1家族,具有結(jié)構(gòu)上的差異。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲(chóng) 熱休克蛋白 致弱尾蚴 表達(dá)譜 熱休克因子 可變剪切
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R532.21
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 前言13-15
• 第一章 日本血吸蟲(chóng)熱休克蛋白及其在正常尾蚴和致弱尾蚴的表達(dá)差異15-36
• 1 材料15-17
• 2 方法17-23
• 3 結(jié)果23-32
• 4 討論32-36
• 第二章 日本血吸蟲(chóng)熱休克因子基因結(jié)構(gòu)特征及其可變剪切亞型分析研究36-55
• 1 材料36-37
• 2 方法37-44
• 3 結(jié)果44-53
• 4 討論53-55
• 結(jié)語(yǔ)及展望55-56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 附錄61-71
• 碩士期間成果71-72
• 致謝72-73

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本文編號(hào)：713329