本文關(guān)鍵詞：IL-22在細(xì)粒棘球蚴感染早期表達(dá)情況的初步研究

  更多相關(guān)文章： 細(xì)粒棘球蚴 IL-22 Th22 Th17 Th1

【摘要】：目的通過(guò)體外原頭蚴與小鼠脾細(xì)胞共培養(yǎng)及體內(nèi)建立細(xì)粒棘球蚴感染小鼠動(dòng)物模型,觀察細(xì)粒棘球蚴感染早期對(duì)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-22表達(dá)情況的影響及對(duì)主要產(chǎn)生IL-22的CD4~+T細(xì)胞比例變化的探討,從而分析其在細(xì)粒棘球蚴感染早期免疫逃逸機(jī)制。方法1.體外實(shí)驗(yàn)無(wú)菌取BALB/c小鼠脾細(xì)胞,分別加入不同濃度原頭蚴及囊液共培養(yǎng)48h,ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液中IL-22表達(dá)量及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)脾細(xì)胞IL-22m RNA的相對(duì)表達(dá)量。同濃度原頭蚴及囊液分別在0h、12h、24h、36h和48h收集細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4~+IL-22~+T細(xì)胞比例變化。1640培養(yǎng)基與脾細(xì)胞共培養(yǎng)設(shè)為對(duì)照組。2.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)建立小鼠細(xì)粒棘球蚴感染模型,BALB/c小鼠6-8周,22±2g,實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔接種活性良好體積為0.2ml的原頭蚴2000個(gè)/只,腹腔注射同等體積無(wú)菌PBS為對(duì)照組;分別于第3、6、9、12天處死小鼠,收集外周血并分離脾細(xì)胞收集肝組織和腸管組織。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)脾細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞亞群Th1、Th17以及Th22比例變化;通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)IL-22、IL-22R1、IFN-γ、IL-17以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Ahr、T-bet、RORγτm RNA和TGF-β1 m RNA的相對(duì)表達(dá)量;ELISA檢測(cè)血清中IL-22、IFN-γ、IL-17及TGF-β1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果1體外試驗(yàn)ELISA和q RT-PCR檢測(cè)顯示在原頭蚴為1000個(gè)/ml和囊液蛋白濃度為2.05mg/ml時(shí)脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-22增加;與對(duì)照組相比,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)原頭蚴組及囊液組CD4~+IL-22~+T細(xì)胞比例隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2體內(nèi)試驗(yàn)(1)與對(duì)照組相比,ELISA檢測(cè)細(xì)粒棘球蚴感染小鼠血清中IFN-γ在感染后第6、9天升高(P0.05);q RT-PCR檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞IFN-γ及Th1型細(xì)胞重要轉(zhuǎn)錄因子T-bet的m RNA水平在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05);流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞中CD4~+IFN-γ~+T細(xì)胞(Th1細(xì)胞)在感染后第6、9天升高(P0.05)。(2)與對(duì)照組相比,ELISA檢測(cè)細(xì)粒棘球蚴感染小鼠血清中IL-17A在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05);q RT-PCR檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞IL-17及Th17型細(xì)胞重要轉(zhuǎn)錄因子RORγτ的m RNA水平在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05);流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞中CD4~+IFN-γ-IL-17~+IL-22~+T細(xì)胞(Th17細(xì)胞)在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05)。(3)與對(duì)照組相比,ELISA檢測(cè)細(xì)粒棘球蚴感染小鼠血清中IL-22在感染后第3、6、9天升高(P0.05);q RT-PCR檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞IL-22及Th22型細(xì)胞重要轉(zhuǎn)錄因子Ahr的m RNA水平在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05);流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞中CD4~+IFN-γ-IL-17-IL-22~+T細(xì)胞(Th22細(xì)胞)在感染后第6、9天升高(P0.05)。(4)與對(duì)照組相比,q RT-PCR檢測(cè)小鼠肝臟及腸管組織細(xì)胞IL-22R1的m RNA水平在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05)。ELISA檢測(cè)細(xì)粒棘球蚴感染小鼠血清中TGF-β在感染后第3、6、9及12天升高(P0.05);q RT-PCR檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞TGF-β的m RNA水平在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05)。結(jié)論1.原頭蚴及囊液均可促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-22,提示IL-22可能參與宿主防御細(xì)粒棘球蚴感染。2.在小鼠細(xì)粒棘球蚴感染早期,主要產(chǎn)生IL-22的CD4~+T細(xì)胞,包括Th1、Th17以及Th22細(xì)胞均增加可能參與了宿主的免疫抗寄生蟲(chóng)防御反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)粒棘球蚴 IL-22 Th22 Th17 Th1
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R532.32
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 前言12-17
• 第一部分 初步探討體外囊液和原頭蚴對(duì)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-22的影響17-33
• 1 材料17-18
• 1.1 主要儀器和試劑17-18
• 1.2 細(xì)粒棘球蚴采集及小鼠來(lái)源18
• 2 方法18-27
• 2.1 原頭蚴制備18-19
• 2.2 小鼠脾細(xì)胞懸液制備19-20
• 2.3 主要溶劑配制及保存20-21
• 2.4 建立體外細(xì)粒棘球蚴及囊液感染小鼠細(xì)胞模型21
• 2.5 檢測(cè)ELISA細(xì)粒棘球蚴感染小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-22表達(dá)量21-22
• 2.6 流式細(xì)胞染色和檢測(cè)22
• 2.7 試劑盒提取檢測(cè)細(xì)粒棘球蚴感染小鼠脾細(xì)胞總RNA22-23
• 2.8 RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA23
• 2.9 PCR反應(yīng)23-25
• 2.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)粒棘球蚴對(duì)小鼠脾細(xì)胞IL-22基因表達(dá)25-26
• 2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析26-27
• 3 結(jié)果27-32
• 3.1 不同濃度原頭蚴對(duì)小鼠脾細(xì)胞分泌IL-22及IL-22mRNA表達(dá)的影響27-28
• 3.2 不同蛋白濃度囊液對(duì)小鼠脾細(xì)胞IL-22分泌及IL-22mRNA表達(dá)的影響28-30
• 3.3 不同作用時(shí)間原頭蚴對(duì)小鼠脾細(xì)胞CD4~+IL-22~+T細(xì)胞比例的影響30-31
• 3.4 不同作用時(shí)間囊液刺激小鼠脾細(xì)胞CD4~+ IL-22~+ T細(xì)胞比例增加31-32
• 4 討論32-33
• 第二部分 細(xì)粒棘球蚴感染早期階段IL-22表達(dá)的初步分析33-56
• 1 材料和試劑33-34
• 2 方法34-41
• 2.1 細(xì)粒棘球蚴采集、形態(tài)觀察、活性鑒定同第一部分34
• 2.2 細(xì)粒棘球蚴感染動(dòng)物模型建立34
• 2.3 小鼠脾細(xì)胞制備同第一部分34
• 2.4 流式細(xì)胞檢測(cè)CD4~+ IFN-γ~+、CD4~+ IFN-γ- IL-22~+ IL17、CD4~+ IFN-γ- IL-22~+ IL-17~+步驟34-35
• 2.5 小鼠肝及腸細(xì)胞總RNA提取35
• 2.6 PCR反應(yīng)35-38
• 2.7 ELISA法檢測(cè)細(xì)粒棘球蚴早期感染小鼠外周血中各炎癥相關(guān)細(xì)胞因子含量38-40
• 2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析同第一部分40-41
• 3 結(jié)果41-54
• 3.1 細(xì)粒棘球蚴感染模型早期小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-22相關(guān)CD4~+T細(xì)胞變化41-42
• 3.2 細(xì)粒棘球蚴感染早期Th1細(xì)胞比例升高42-44
• 3.3 細(xì)粒棘球蚴感染早期Th17細(xì)胞比例升高44-47
• 3.4 細(xì)粒棘球蚴感染早期Th22細(xì)胞比例升高47-49
• 3.5 細(xì)粒棘球蚴感染早期肝臟及腸管IL-22R1 m RNA表達(dá)水平增加49-51
• 3.6 細(xì)粒棘球蚴感染早期TGF-β1 表達(dá)升高51-52
• 3.7 體外加入重組細(xì)胞因子IL-22促進(jìn)感染小鼠脾細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)52-54
• 4 討論54-56
• 4.1 Th1細(xì)胞、細(xì)胞因子IFN-γ以及其主要轉(zhuǎn)錄因子T-bet在細(xì)粒棘球蚴感染早期的變化54
• 4.2 Th17 細(xì)胞、細(xì)胞因子 IL-17 以及轉(zhuǎn)錄因子 RORγι在細(xì)粒棘球蚴感染早期的變化54-55
• 4.3 Th22 細(xì)胞、細(xì)胞因子 IL-22、IL-22R1 以及轉(zhuǎn)錄因子 Ahr 在細(xì)粒棘球蚴感染早期變化55
• 4.4 TGF-β在細(xì)粒棘球蚴感染早期階段的表達(dá)水平55-56
• 4.5 體外加入重組細(xì)胞因子 IL-22 促進(jìn)感染小鼠脾細(xì)胞 IFN-γ的表達(dá)56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 文獻(xiàn)綜述61-70
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 致謝70-71
• 作者簡(jiǎn)介71-72
• 導(dǎo)師評(píng)閱表72

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