本文關(guān)鍵詞：IL-22在細粒棘球蚴感染早期表達情況的初步研究

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【摘要】：目的通過體外原頭蚴與小鼠脾細胞共培養(yǎng)及體內(nèi)建立細粒棘球蚴感染小鼠動物模型,觀察細粒棘球蚴感染早期對小鼠脾細胞產(chǎn)生IL-22表達情況的影響及對主要產(chǎn)生IL-22的CD4~+T細胞比例變化的探討,從而分析其在細粒棘球蚴感染早期免疫逃逸機制。方法1.體外實驗無菌取BALB/c小鼠脾細胞,分別加入不同濃度原頭蚴及囊液共培養(yǎng)48h,ELISA檢測培養(yǎng)上清液中IL-22表達量及實時定量PCR檢測脾細胞IL-22m RNA的相對表達量。同濃度原頭蚴及囊液分別在0h、12h、24h、36h和48h收集細胞,通過流式細胞術(shù)檢測CD4~+IL-22~+T細胞比例變化。1640培養(yǎng)基與脾細胞共培養(yǎng)設(shè)為對照組。2.體內(nèi)實驗建立小鼠細粒棘球蚴感染模型,BALB/c小鼠6-8周,22±2g,實驗組小鼠腹腔接種活性良好體積為0.2ml的原頭蚴2000個/只,腹腔注射同等體積無菌PBS為對照組;分別于第3、6、9、12天處死小鼠,收集外周血并分離脾細胞收集肝組織和腸管組織。用流式細胞儀檢測脾細胞中T淋巴細胞亞群Th1、Th17以及Th22比例變化;通過實時定量PCR法檢測IL-22、IL-22R1、IFN-γ、IL-17以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Ahr、T-bet、RORγτm RNA和TGF-β1 m RNA的相對表達量;ELISA檢測血清中IL-22、IFN-γ、IL-17及TGF-β1的蛋白表達水平。結(jié)果1體外試驗ELISA和q RT-PCR檢測顯示在原頭蚴為1000個/ml和囊液蛋白濃度為2.05mg/ml時脾細胞產(chǎn)生IL-22增加;與對照組相比,流式細胞術(shù)檢測原頭蚴組及囊液組CD4~+IL-22~+T細胞比例隨作用時間的延長而逐漸增加,差異有統(tǒng)計學意義。2體內(nèi)試驗(1)與對照組相比,ELISA檢測細粒棘球蚴感染小鼠血清中IFN-γ在感染后第6、9天升高(P0.05);q RT-PCR檢測小鼠脾細胞IFN-γ及Th1型細胞重要轉(zhuǎn)錄因子T-bet的m RNA水平在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05);流式細胞儀檢測小鼠脾細胞中CD4~+IFN-γ~+T細胞(Th1細胞)在感染后第6、9天升高(P0.05)。(2)與對照組相比,ELISA檢測細粒棘球蚴感染小鼠血清中IL-17A在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05);q RT-PCR檢測小鼠脾細胞IL-17及Th17型細胞重要轉(zhuǎn)錄因子RORγτ的m RNA水平在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05);流式細胞儀檢測小鼠脾細胞中CD4~+IFN-γ-IL-17~+IL-22~+T細胞(Th17細胞)在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05)。(3)與對照組相比,ELISA檢測細粒棘球蚴感染小鼠血清中IL-22在感染后第3、6、9天升高(P0.05);q RT-PCR檢測小鼠脾細胞IL-22及Th22型細胞重要轉(zhuǎn)錄因子Ahr的m RNA水平在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05);流式細胞儀檢測小鼠脾細胞中CD4~+IFN-γ-IL-17-IL-22~+T細胞(Th22細胞)在感染后第6、9天升高(P0.05)。(4)與對照組相比,q RT-PCR檢測小鼠肝臟及腸管組織細胞IL-22R1的m RNA水平在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05)。ELISA檢測細粒棘球蚴感染小鼠血清中TGF-β在感染后第3、6、9及12天升高(P0.05);q RT-PCR檢測小鼠脾細胞TGF-β的m RNA水平在感染后第3、6、9及12天均升高(P0.05)。結(jié)論1.原頭蚴及囊液均可促進小鼠脾細胞產(chǎn)生IL-22,提示IL-22可能參與宿主防御細粒棘球蚴感染。2.在小鼠細粒棘球蚴感染早期,主要產(chǎn)生IL-22的CD4~+T細胞,包括Th1、Th17以及Th22細胞均增加可能參與了宿主的免疫抗寄生蟲防御反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：細粒棘球蚴 IL-22 Th22 Th17 Th1
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R532.32
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 前言12-17
• 第一部分 初步探討體外囊液和原頭蚴對小鼠脾細胞產(chǎn)生IL-22的影響17-33
• 1 材料17-18
• 1.1 主要儀器和試劑17-18
• 1.2 細粒棘球蚴采集及小鼠來源18
• 2 方法18-27
• 2.1 原頭蚴制備18-19
• 2.2 小鼠脾細胞懸液制備19-20
• 2.3 主要溶劑配制及保存20-21
• 2.4 建立體外細粒棘球蚴及囊液感染小鼠細胞模型21
• 2.5 檢測ELISA細粒棘球蚴感染小鼠脾細胞細胞培養(yǎng)上清中IL-22表達量21-22
• 2.6 流式細胞染色和檢測22
• 2.7 試劑盒提取檢測細粒棘球蚴感染小鼠脾細胞總RNA22-23
• 2.8 RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA23
• 2.9 PCR反應(yīng)23-25
• 2.10 實時熒光定量PCR檢測細粒棘球蚴對小鼠脾細胞IL-22基因表達25-26
• 2.11 統(tǒng)計學分析26-27
• 3 結(jié)果27-32
• 3.1 不同濃度原頭蚴對小鼠脾細胞分泌IL-22及IL-22mRNA表達的影響27-28
• 3.2 不同蛋白濃度囊液對小鼠脾細胞IL-22分泌及IL-22mRNA表達的影響28-30
• 3.3 不同作用時間原頭蚴對小鼠脾細胞CD4~+IL-22~+T細胞比例的影響30-31
• 3.4 不同作用時間囊液刺激小鼠脾細胞CD4~+ IL-22~+ T細胞比例增加31-32
• 4 討論32-33
• 第二部分 細粒棘球蚴感染早期階段IL-22表達的初步分析33-56
• 1 材料和試劑33-34
• 2 方法34-41
• 2.1 細粒棘球蚴采集、形態(tài)觀察、活性鑒定同第一部分34
• 2.2 細粒棘球蚴感染動物模型建立34
• 2.3 小鼠脾細胞制備同第一部分34
• 2.4 流式細胞檢測CD4~+ IFN-γ~+、CD4~+ IFN-γ- IL-22~+ IL17、CD4~+ IFN-γ- IL-22~+ IL-17~+步驟34-35
• 2.5 小鼠肝及腸細胞總RNA提取35
• 2.6 PCR反應(yīng)35-38
• 2.7 ELISA法檢測細粒棘球蚴早期感染小鼠外周血中各炎癥相關(guān)細胞因子含量38-40
• 2.8 統(tǒng)計學分析同第一部分40-41
• 3 結(jié)果41-54
• 3.1 細粒棘球蚴感染模型早期小鼠脾細胞產(chǎn)生IL-22相關(guān)CD4~+T細胞變化41-42
• 3.2 細粒棘球蚴感染早期Th1細胞比例升高42-44
• 3.3 細粒棘球蚴感染早期Th17細胞比例升高44-47
• 3.4 細粒棘球蚴感染早期Th22細胞比例升高47-49
• 3.5 細粒棘球蚴感染早期肝臟及腸管IL-22R1 m RNA表達水平增加49-51
• 3.6 細粒棘球蚴感染早期TGF-β1 表達升高51-52
• 3.7 體外加入重組細胞因子IL-22促進感染小鼠脾細胞IFN-γ的表達52-54
• 4 討論54-56
• 4.1 Th1細胞、細胞因子IFN-γ以及其主要轉(zhuǎn)錄因子T-bet在細粒棘球蚴感染早期的變化54
• 4.2 Th17 細胞、細胞因子 IL-17 以及轉(zhuǎn)錄因子 RORγι在細粒棘球蚴感染早期的變化54-55
• 4.3 Th22 細胞、細胞因子 IL-22、IL-22R1 以及轉(zhuǎn)錄因子 Ahr 在細粒棘球蚴感染早期變化55
• 4.4 TGF-β在細粒棘球蚴感染早期階段的表達水平55-56
• 4.5 體外加入重組細胞因子 IL-22 促進感染小鼠脾細胞 IFN-γ的表達56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻57-61
• 文獻綜述61-70
• 參考文獻66-70
• 致謝70-71
• 作者簡介71-72
• 導師評閱表72

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本文編號：707645