本文關(guān)鍵詞：基于環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)的人類腸道病毒區(qū)域性流行型別變遷及分子流行病學(xué)研究

  更多相關(guān)文章： 環(huán)境監(jiān)測(cè) 懸浮顆粒物 腸道病毒 山東地方株 分子流行病學(xué)

【摘要】：[背景]腸道病毒(Enteroviruses, EV)是生活在人類腸道中的一類常見病毒,多為無癥狀感染,但也可引起多種嚴(yán)重的或潛在的致死性疾病如脊髓灰質(zhì)炎、腦炎、手足口病、出血性結(jié)膜炎和急性心肌炎等。近年的研究還表明,EV感染與某些慢性疾病有關(guān),如Ⅰ型糖尿病、甲狀腺炎等。EV在世界范圍內(nèi)廣泛分布,無明顯地域性差異。隨著當(dāng)前各國(guó)間國(guó)際交流日益頻繁,EV流行范圍早已超過人們最初的預(yù)期,并且自然界中EV生存環(huán)境的改變很可能會(huì)加速病毒的變異。EV所致疾病主要為散發(fā)或呈地區(qū)性暴發(fā)。在非流行期,特定區(qū)域通常有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)型別共循環(huán),而在暴發(fā)時(shí)期,往往會(huì)在同一地區(qū)分離到大量同一型別毒株。長(zhǎng)期以來,EV感染是嚴(yán)重威脅公眾特別是兒童健康與生命安全的重大公共衛(wèi)生問題之一,加強(qiáng)EV分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè),對(duì)于預(yù)防控制EV相關(guān)疾病具有重要理論和實(shí)際意義。EV以隱性感染為主,隱性感染者可持續(xù)數(shù)周向外環(huán)境排泄大量病毒,故EV常在下水道污水、江河水中檢出,甚至污染飲用水水源。環(huán)境中的EV可以通過不同的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行濃縮、分離及鑒定,以作為EV流行病學(xué)研究的一個(gè)補(bǔ)充方法,稱為環(huán)境監(jiān)測(cè)。生活污水是特定地區(qū)EV在環(huán)境中的豐富來源。環(huán)境監(jiān)測(cè)可以獲得特定地區(qū)EV的循環(huán)信息,包括有癥狀的感染和隱性感染,并有可能在人群產(chǎn)生臨床癥狀之前就在生活污水中檢出EV。EV在環(huán)境水體中廣泛存在,可在多種環(huán)境水體中被分離,但其滴度相對(duì)較低,且容易在水中懸浮物上附著,比臨床標(biāo)本更難檢出。因此,環(huán)境水體標(biāo)本檢測(cè)前必須進(jìn)行大量水體的濃縮富集,這是決定EV能否成功分離的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。膜吸附-洗脫法是目前實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的濃縮方法,在病毒的環(huán)境監(jiān)測(cè)以及相關(guān)疾病的病原體檢測(cè)方面可以發(fā)揮很大作用。EV是相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一,近年來對(duì)其進(jìn)行了廣泛的流行病學(xué)及病毒學(xué)研究。目前,全球已有相當(dāng)數(shù)量的國(guó)家開展環(huán)境生活污水標(biāo)本的監(jiān)測(cè)研究,以了解當(dāng)?shù)丶顾杌屹|(zhì)炎(脊灰)病毒(Poliovirus, PV)和非脊灰腸道病毒(Non-polio Enteroviruses, NPEV)的循環(huán)狀況和開展相關(guān)研究,而國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域研究較少。[研究目的]1.在前期研究的基礎(chǔ)上,繼續(xù)優(yōu)化環(huán)境生活污水標(biāo)本中EV的濃縮分離方法,以完善方法學(xué),提高檢測(cè)效率；探討污水標(biāo)本中懸浮顆粒物對(duì)病毒吸附和分離的影響。2.通過環(huán)境監(jiān)測(cè)和病例監(jiān)測(cè),明確2012～2014年山東地區(qū)EV型別分布、傳播和頻率,為相關(guān)疾病的流行病學(xué)研究提供支持。3.補(bǔ)充完善山東省環(huán)境生活污水標(biāo)本EV分離株各型別的VP1區(qū)基因數(shù)據(jù)庫(kù),研究山東省EV的基因特征和長(zhǎng)期循環(huán)動(dòng)態(tài)變化,為EV分子流行病學(xué)研究提供有價(jià)值的補(bǔ)充。[研究方法]1.環(huán)境監(jiān)測(cè)：本研究選擇濟(jì)南市光大污水處理廠、臨沂市首創(chuàng)水務(wù)公司作為采樣點(diǎn),之后在2013年9月又納入煙臺(tái)市辛安河污水處理廠作為采樣點(diǎn),分別在其生活污水的入口處采用定時(shí)采樣法采集污水標(biāo)本,使用陰離子膜吸附-超聲波振蕩法進(jìn)行濃縮富集,接種RD和Hep-2細(xì)胞進(jìn)行病毒分離。2.病例監(jiān)測(cè)：本研究選擇山東省2012～2014年急性弛緩性麻痹(AFP)和急性腦膜炎腦炎綜合癥(AMES)兩種疾病監(jiān)測(cè)系統(tǒng)中分離的EV進(jìn)行分析。3.基因擴(kuò)增及型別鑒定：提取病毒RNA,使用RT-PCR擴(kuò)增VP1編碼區(qū),對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。將各分離株的VP1編碼區(qū)序列通過與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),進(jìn)而確定EV血清型別。4.生物信息學(xué)分析：使用BioEdit 7.0.9.0軟件,對(duì)生活污水和病例標(biāo)本中的EV分離株以及GenBank中公布的相關(guān)EV VP1核苷酸序列進(jìn)行同源性比較。使用MEGA 5.0軟件,通過鄰位法(Neighbor-joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,建樹的可靠性通過1000Bootstrap評(píng)估。通過比較,研究山東地區(qū)EV的基因特征、變異及其進(jìn)化來源。[主要結(jié)果]1.陰離子膜吸附洗脫法的優(yōu)化：通過加標(biāo)回收試驗(yàn),比較不同pH值洗脫液和不同超聲波振蕩次數(shù)對(duì)EV的回收率,確定最優(yōu)洗脫條件為：洗脫液pH為9.0,超聲振蕩時(shí)間設(shè)定為振蕩1次,持續(xù)3min。2.環(huán)境污水中懸浮顆粒物對(duì)EV的吸附作用：環(huán)境污水為酸性時(shí),有利于EV吸附到懸浮顆粒物上；EV含量對(duì)懸浮顆粒物的吸附作用基本沒有影響。環(huán)境污水中懸浮顆粒物濃度增加,吸附到顆粒物上的病毒滴度及吸附率呈上升趨勢(shì),吸附在其中的病毒的洗脫率呈明顯下降趨勢(shì),總體的顆粒物回收效率在特定的濃度范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。環(huán)境污水標(biāo)本中懸浮顆粒物對(duì)E-3的吸附作用較強(qiáng),對(duì)E-6的吸附作用較弱。3.環(huán)境監(jiān)測(cè)和病例監(jiān)測(cè)標(biāo)本的采集和病毒分離情況：2012～2014年環(huán)境監(jiān)測(cè)標(biāo)本共分離到EV 2010株,包括NPEV 1468株,優(yōu)勢(shì)血清型別為E-7、CV-B5、 E-6、E-3、E-11、CV-B3; PV542株,其中發(fā)現(xiàn)1株Ⅱ型疫苗衍生株脊灰病毒(VDPV)E12-221,以及12株高變異株病毒(pre-VDPV).各市不同月份的NPEV型別譜各有不同,不同血清型別的毒株有不同的時(shí)間循環(huán)模式。AFP監(jiān)測(cè)病例共分離到NPEV119株,包括27種型別；PV 35株,未檢出VDPV毒株及PV野毒株。2014年AMES監(jiān)測(cè)病例中,收集標(biāo)本798份,分離到EV 152株,陽(yáng)性率為19.1%。其中,CV-B5、E6、E-30分離數(shù)目較多,占總分離數(shù)的92.8%,還分離到E-7、E-25及1例E-3與E-6的混合感染。4.EV優(yōu)勢(shì)血清型別的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析：E-7分離數(shù)目最多,分離株之間同源性較低,存在多個(gè)傳播鏈共循環(huán)。E-3核苷酸和氨基酸變異較小,在遺傳進(jìn)化上較為穩(wěn)定,具有明顯的時(shí)間和地域聚集性。CV-B5分離株之間同源性較高,存在兩個(gè)傳播鏈,在山東省內(nèi)傳播迅速,廣泛流行。CV-B3分離株之間核苷酸差異較小,進(jìn)化分支具有明顯的時(shí)間聚集特征。E-6分離株核苷酸差異較大,保持著較快的進(jìn)化速度,山東省內(nèi)存在至少兩條傳播鏈的共循環(huán)。E-11分離株包括Gergory-like和Silva-like毒株,分為明顯的兩個(gè)進(jìn)化分支,之間的核苷酸差異較大。[主要結(jié)論]1.根據(jù)加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果,通過優(yōu)化洗脫液pH值、超聲振蕩時(shí)間和次數(shù),確定了污水標(biāo)本的陰離子膜吸附-超聲波振蕩法的最優(yōu)洗脫條件。2.環(huán)境污水中懸浮顆粒物對(duì)EV具有較強(qiáng)的吸附作用,并受到多種因素的影響,其分離型別構(gòu)成與上清中差異不大,但各血清型別分離率存在差異。建立了從懸浮顆粒物中洗脫濃縮EV的方法。在今后的環(huán)境監(jiān)測(cè)中,應(yīng)綜合采用污水上清和懸浮顆粒物進(jìn)行分離分析。3.環(huán)境監(jiān)測(cè)和病例監(jiān)測(cè)中主要分離到的是EV-B組病毒,A組、C組病毒分離株數(shù)較少。NPEV分離株的優(yōu)勢(shì)血清型別為E-7、CV-B5、E-6、E-3、E-11、 CV-B3。各市不同月份的NPEV型別譜各有不同,不同血清型別的毒株有不同的時(shí)間循環(huán)模式。4.環(huán)境污水中分離到的PV均為疫苗株,無野病毒。國(guó)內(nèi)首次從環(huán)境污水中發(fā)現(xiàn)疫苗衍生株脊灰病毒。5.山東省EV各優(yōu)勢(shì)血清型分離株進(jìn)化速度較快,變異活躍,存在多條傳播鏈的共同流行,環(huán)境監(jiān)測(cè)與病例監(jiān)測(cè)優(yōu)勢(shì)株之間存在一定的遺傳進(jìn)化關(guān)系。6.環(huán)境監(jiān)測(cè)對(duì)EV具有較高的敏感性,能夠獲得外環(huán)境中EV的流行情況和時(shí)間循環(huán)模式,也可以作為AFP監(jiān)測(cè)系統(tǒng)之外評(píng)估人群中PV流行的一種補(bǔ)充手段,為預(yù)防控制相關(guān)疾病提供科學(xué)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：環(huán)境監(jiān)測(cè) 懸浮顆粒物 腸道病毒 山東地方株 分子流行病學(xué)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.5
【目錄】：

• 中文摘要10-14
• 英文摘要14-19
• 英文縮略詞說明19-21
• 前言21-29
• 1 研究背景21-26
• 1.1 概述21-22
• 1.2 EV基因組結(jié)構(gòu)及進(jìn)化22-23
• 1.3 EV流行病學(xué)23-24
• 1.4 環(huán)境污水標(biāo)本中EV的濃縮富集和檢測(cè)24-25
• 1.5 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀25-26
• 2 研究目的與意義26-28
• 2.1 本研究的目的26-27
• 2.2 本研究的意義27-28
• 3 本研究的技術(shù)路線28-29
• 材料與方法29-40
• 1 環(huán)境污水標(biāo)本的采集和濃縮富集29-31
• 1.1 主要試劑和儀器設(shè)備29
• 1.2 方法29-31
• 2 病例標(biāo)本的采集與處理31-33
• 2.1 主要試劑和儀器設(shè)備31-32
• 2.2 方法32-33
• 3 細(xì)胞培養(yǎng)33-35
• 3.1 主要試劑和儀器設(shè)備33-34
• 3.2 方法34-35
• 4 病毒的分離35
• 4.1 主要試劑和儀器設(shè)備35
• 4.2 方法35
• 5 核酸提取、基因擴(kuò)增及序列測(cè)定35-37
• 5.1 主要試劑和儀器設(shè)備35-36
• 5.2 研究方法36-37
• 6 瓊脂糖凝膠電泳37-38
• 6.1 主要試劑與儀器設(shè)備37-38
• 6.2 研究方法38
• 7 生物學(xué)信息分析38
• 8 質(zhì)量控制38-40
• 8.1 方案設(shè)計(jì)階段38-39
• 8.2 調(diào)查實(shí)施階段39
• 8.3 數(shù)據(jù)分析階段39-40
• 結(jié)果40-84
• 1 陰離子膜吸附洗脫法的優(yōu)化40-41
• 1.1 陰離子膜吸附中不同pH值洗脫液對(duì)EV回收率的比較40
• 1.2 不同超聲波振蕩洗脫次數(shù)對(duì)EV回收率的比較40-41
• 2 環(huán)境污水中懸浮顆粒物對(duì)EV的吸附作用41-46
• 2.1 懸浮顆粒物對(duì)EV吸附作用的影響條件41-44
• 2.2 環(huán)境標(biāo)本上清和懸浮顆粒物中EV的分離情況44-46
• 3 環(huán)境監(jiān)測(cè)和病例監(jiān)測(cè)標(biāo)本的采集和病毒分離情況46-59
• 3.1 環(huán)境污水標(biāo)本的采集與EV分離簡(jiǎn)況46-48
• 3.2 環(huán)境監(jiān)測(cè)和病例監(jiān)測(cè)中EV分離情況48-59
• 4 EV優(yōu)勢(shì)型別的系統(tǒng)進(jìn)化分析59-84
• 4.1 E-7的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析59-64
• 4.2 E-3的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析64-68
• 4.3 CV-B5的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析68-72
• 4.4 CV-B3的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析72-76
• 4.5 E-6的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析76-80
• 4.6 E-11的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析80-84
• 討論84-97
• 1 陰離子膜吸附洗脫法的優(yōu)化85
• 2 環(huán)境污水中懸浮顆粒物對(duì)EV的吸附作用85-86
• 3 環(huán)境污水中的病毒分離構(gòu)成86-90
• 4 EV優(yōu)勢(shì)血清型別的系統(tǒng)進(jìn)化分析90-97
• 4.1 E-7的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析90-91
• 4.2 E-3的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析91-92
• 4.3 CV-B5的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析92-93
• 4.4 CV-B3的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析93-94
• 4.5 E-6的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析94-95
• 4.6 E-11的同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析95-97
• 結(jié)論97-98
• 本研究主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)及不足之處98-99
• 參考文獻(xiàn)99-107
• 致謝107-108
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文108-109
• 附件109

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

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本文編號(hào)：698611