本文關(guān)鍵詞：封閉galectins對(duì)伯氏瘧原蟲感染小鼠肝臟巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用研究

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【摘要】：研究背景瘧疾(malaria)是一種由瘧原蟲(Plasmodium spp.)引起的、以按蚊為媒介傳播的全球性寄生蟲病,是世界六大熱帶病和我國五大寄生蟲病之一,目前全世界約有一半人口面臨瘧疾風(fēng)險(xiǎn)。瘧疾是一種急性發(fā)熱性疾病,最初癥狀如發(fā)熱、頭痛、寒戰(zhàn)和嘔吐可能因癥狀較輕而難以發(fā)現(xiàn),而像兒童和孕婦等免疫力低下的人群常常發(fā)展為重癥瘧疾,出現(xiàn)貧血、急性呼吸窘迫、黃疸等癥狀,可造成腦、肺、肝、腎等全身各臟器不同程度的損害,最終可導(dǎo)致死亡。目前由于人口流動(dòng)頻繁,生態(tài)環(huán)境改變以及抗瘧藥耐藥性的產(chǎn)生等綜合因素,瘧疾對(duì)人類健康的威脅仍然不容忽視。在重癥瘧疾患者普遍都能觀察到不同程度的肝功能障礙,嚴(yán)重的患者可出現(xiàn)肝功能衰竭和肝細(xì)胞壞死,這與肝內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤和免疫病理反應(yīng)密切相關(guān)。Kupffer細(xì)胞(KCs)是肝臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞,構(gòu)成機(jī)體防御的一道屏障,同時(shí)免疫細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子也是導(dǎo)致肝損傷的重要原因之一。紅細(xì)胞內(nèi)期是瘧疾致病的主要階段,肝臟微血管內(nèi)的瘧原蟲通過表面特異性標(biāo)志入侵、增殖并裂解紅細(xì)胞,促使肝臟內(nèi)的KCs大量聚集。這個(gè)過程可導(dǎo)致肝臟損害,說明單核巨噬細(xì)胞的浸潤增生參與肝臟的免疫病理反應(yīng)。同時(shí),瘧原蟲感染可誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)的產(chǎn)生,通過IFN-α/β激活基因(ISGs)募集大量炎性細(xì)胞在肝內(nèi)聚集,參與固有免疫反應(yīng)來遏制瘧原蟲的增殖。因此,維持各種炎癥因子之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)瘧疾的結(jié)局甚為關(guān)鍵,但其具體的調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子家族(T cell immunoglobulin mucin,Tim)是一類結(jié)構(gòu)保守并具有重要免疫功能的新型的基因家族蛋白,其中Tim-3主要表達(dá)在Th1細(xì)胞上,能產(chǎn)生抑制信號(hào)導(dǎo)致Th1細(xì)胞的凋亡,下調(diào)Th1介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。凝集素家族中的半乳糖凝集素(Galectin,Gal)-9是Tim-3主要的天然配體,主要表達(dá)于CD4+T細(xì)胞表面。其選擇性地結(jié)合β-半乳糖苷,與Th1細(xì)胞上的Tim-3分子特異性結(jié)合后負(fù)性刺激Th1細(xì)胞程序性死亡來抑制Th1細(xì)胞免疫功能。在病原體感染中,Tim-3和Gal-9的相互作用促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬病原體同時(shí)抑制T細(xì)胞應(yīng)答,在急性炎癥中促進(jìn)T細(xì)胞凋亡而在慢性炎癥中介導(dǎo)CD8+T細(xì)胞耗竭與無能。研究顯示,NKT細(xì)胞Tim-3表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)KCs表達(dá)Gal-9,同時(shí)分泌IFN-γ導(dǎo)致Tim-3+NKT細(xì)胞的凋亡,可限制了炎癥反應(yīng)并避免破壞性免疫。目前關(guān)于Tim-3/Gal-9在瘧疾肝損傷中的作用報(bào)道尚少見,本研究對(duì)其進(jìn)行探討,以期為瘧疾肝損傷的防治提供新的靶向目標(biāo)。研究目的和意義本論文采用Plasmodium berghei ANKA(Pb ANKA)感染小鼠,通過乳糖封閉galectins研究伯氏瘧原蟲感染小鼠肝臟巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用研究。我們的研究結(jié)果顯示,Tim-3/Gal-9通路作用于KCs,可能通過調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素的分泌參與瘧原蟲伯氏感染小鼠肝臟的免疫病理反應(yīng)。第一部分1)材料和方法(1)伯氏瘧原蟲感染小鼠模型的建立雌性昆明小鼠腹腔注射感染1.0×106個(gè)Pb ANKA,建立鼠瘧模型。(2)伯氏瘧原蟲感染小鼠分組及觀察感染后觀察小鼠生存狀況;每2日從小鼠尾部采血,制備薄血膜,檢測(cè)小鼠血蟲感染率的動(dòng)態(tài)變化,分別于感染后5、10、15和20天處死小鼠。(3)伯氏瘧原蟲感染小鼠組織蟲荷檢測(cè)采用q RT-PCR檢測(cè)小鼠感染后5、10、15和20天肝、脾組織Pb ANKA蟲荷m RNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。(4)伯氏瘧原蟲感染小鼠組織病理觀察肝、脾組織石蠟切片后進(jìn)行HE染色,觀察并計(jì)數(shù)分析小鼠感染后肝、脾組織病理動(dòng)態(tài)變化。(5)伯氏瘧原蟲感染小鼠組織Tim-3和Gal-9免疫組織化學(xué)染色肝、脾組織石蠟切片后進(jìn)行Tim-3和Gal-9免疫組織化學(xué)染色,觀察并計(jì)數(shù)小鼠感染后肝、脾組織Tim-3和Gal-9陽性細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)表達(dá)。(6)伯氏瘧原蟲感染小鼠組織細(xì)胞因子檢測(cè)采用q RT-PCR檢測(cè)小鼠感染后肝、脾組織Tim-3、Gal-9、促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)和抑炎因子(IL-10和IL-4)的m RNA表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化。2)結(jié)果(1)小鼠感染后7至20天內(nèi)死亡,臨死前的血蟲感染率為62.61% 78.63%。(2)感染小鼠肝、脾組織中Pb ANKA蟲荷量動(dòng)態(tài)升高。與感染后5天相比,肝臟和脾臟組織蟲荷量在感染后10(P0.05)、15(P0.001)和20天(P0.001)顯著增高;與感染后10天相比,肝臟和脾臟組織中的蟲荷量在感染后15和20天顯著增高(分別為P0.001和P0.05)。(3)感染小鼠肝、脾組織病理損害隨著時(shí)間的延長逐漸加重。(4)小鼠感染后肝、脾組織中Tim-3和Gal-9陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。(5)與正常小鼠相比,感染小鼠肝臟組織中Tim-3的m RNA表達(dá)水平顯著升高,且小鼠感染后20天肝臟組織Tim-3的m RNA表達(dá)水平顯著高于其他動(dòng)態(tài)時(shí)間點(diǎn)(P0.001)。與正常小鼠相比,感染小鼠肝臟組織中Gal-9的m RNA表達(dá)水平在5和10天顯著升高(P0.001)。與正常小鼠相比,感染小鼠脾臟組織Gal-9的m RNA表達(dá)水平在10和15天顯著升高(分別為P0.001和P0.05)。(6)與正常小鼠相比,肝臟組織IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10的m RNA表達(dá)水平在小鼠感染后顯著升高,而IL-4的m RNA表達(dá)水平在小鼠感染后顯著降低;與正常小鼠相比,脾臟組織IL-6和IL-10的m RNA表達(dá)水平在小鼠感染后各動(dòng)態(tài)時(shí)間點(diǎn)顯著升高,IL-1β的m RNA表達(dá)水平在小鼠感染后顯著降低。3)結(jié)論小鼠感染伯氏瘧原蟲后,隨著感染時(shí)間的延長,小鼠肝、脾組織中的蟲荷量增加;肝、脾組織病理損害加重;肝、脾組織中的Tim-3和Gal-9陽性細(xì)胞數(shù)量升高,提示Tim-3和Gal-9可能參與伯氏瘧原蟲感染小鼠肝臟的免疫病理反應(yīng)。第二部分1)材料和方法(1)伯氏瘧原蟲感染小鼠模型的建立雌性昆明小鼠腹腔注射感染1.0×106個(gè)Pb ANKA,建立鼠瘧模型。(2)伯氏瘧原蟲感染小鼠分組及觀察感染的部分小鼠每隔12 h腹腔注射300 m M的α-乳糖溶液封閉galectins作為乳糖封閉感染組,剩余感染小鼠作為感染組,另設(shè)正常對(duì)照組和注射同等劑量的乳糖對(duì)照組,觀察感染組和乳糖封閉感染組小鼠生存狀況;每日從小鼠尾部采血,制備薄血膜,檢測(cè)感染組和乳糖封閉感染組小鼠血蟲感染率的動(dòng)態(tài)變化,分別于感染后5和7天處死小鼠。(3)伯氏瘧原蟲感染小鼠肝組織蟲荷量檢測(cè)采用q RT-PCR檢測(cè)感染組和乳糖封閉感染組小鼠感染后5和7天肝臟組織Pb ANKA蟲荷m RNA表達(dá)水平。(4)伯氏瘧原蟲感染小鼠肝組織病理觀察肝臟組織石蠟切片后HE染色,觀察并計(jì)數(shù)各組小鼠肝臟組織病理變化。(5)伯氏瘧原蟲感染小鼠肝組織CD68免疫組織化學(xué)染色肝臟組織石蠟切片后CD68免疫組織化學(xué)染色,觀察并計(jì)數(shù)各組小鼠肝臟組織CD68陽性細(xì)胞數(shù)量的表達(dá)。(6)伯氏瘧原蟲感染小鼠肝組織Tim-3和CD68、Gal-9和CD68熒光雙染肝臟組織石蠟切片后進(jìn)行Tim-3和CD68、Gal-9和CD68免疫熒光雙染,觀察各組小鼠肝臟組織中KCs上Tim-3和Gal-9的表達(dá)情況。(7)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞與感染瘧原蟲的紅細(xì)胞共培養(yǎng)將小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞與感染瘧原蟲的紅細(xì)胞以10:1的感染復(fù)數(shù)體外共培養(yǎng)24 h,采用q RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞Tim-3和Gal-9的m RNA表達(dá)水平,并比較乳糖封閉galectins后細(xì)胞IFN-α/β的m RNA表達(dá)變化情況。(8)伯氏瘧原蟲感染小鼠肝組織Ⅰ和Ⅱ型干擾素檢測(cè)采用q RT-PCR檢測(cè)各組小鼠肝臟組織Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)和Ⅱ型(IFN-γ)干擾素的m RNA表達(dá)水平。(9)伯氏瘧原蟲感染小鼠肝組織細(xì)胞因子檢測(cè)采用q RT-PCR檢測(cè)各組小鼠肝臟組織促炎因子(IL-6、IL-12和TNF-α)和抑炎因子(IL-10)的m RNA表達(dá)水平。(10)伯氏瘧原蟲感染小鼠肝組織細(xì)胞凋亡觀察各組小鼠肝臟組織TUNEL染色,觀察并計(jì)數(shù)各組肝臟組織細(xì)胞凋亡情況。2)結(jié)果(1)重癥瘧疾小鼠在感染后7至10天內(nèi)死亡,而采用乳糖封閉galectins的小鼠在感染后5至7天內(nèi)死亡,且乳糖封閉感染組小鼠的血蟲感染率在感染后4、5和6天顯著高于感染組(P0.05)。(2)感染后5和7天乳糖封閉感染組小鼠的肝臟組織中Pb ANKA蟲荷量顯著高于感染組。(3)與正常對(duì)照組和乳糖對(duì)照組相比,感染組和乳糖封閉感染組小鼠肝臟組織的病理損害在感染后5和7天均顯著加重,且感染后5和7天乳糖封閉感染組小鼠的病理評(píng)分均顯著高于感染組。(4)與正常對(duì)照組和乳糖對(duì)照組相比,感染組和乳糖封閉感染組小鼠肝臟組織的CD68+KCs在感染后5和7天均顯著增多,且乳糖封閉感染組小鼠肝臟組織的CD68+KCs在感染后5和7天均高于感染組(P0.001)。(5)各組小鼠肝臟組織均不同程度地出現(xiàn)了表達(dá)Tim-3和Gal-9的KCs。正常對(duì)照組和乳糖對(duì)照組小鼠肝臟組織的KCs數(shù)量較少,Tim-3和Gal-9的表達(dá)較弱;而感染組和乳糖封閉感染組小鼠肝臟組織的KCs數(shù)量明顯增多,Tim-3和Gal-9的表達(dá)較強(qiáng),且乳糖封閉感染組比感染組KCs數(shù)量和Tim-3和Gal-9的表達(dá)更甚。(6)與空白對(duì)照組相比,小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞與感染伯氏瘧原蟲的紅細(xì)胞共培養(yǎng)后Tim-3和Gal-9的m RNA表達(dá)水平顯著升高(P0.001);而與正常對(duì)照組和乳糖對(duì)照組相比,小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞與感染伯氏瘧原蟲的紅細(xì)胞共培養(yǎng)后IFN-ɑ/β的m RNA表達(dá)水平均顯著升高(P0.001)但乳糖封閉galectins后IFN-ɑ/β的m RNA表達(dá)水平卻明顯降低(P0.001)。(7)與正常對(duì)照組和乳糖對(duì)照組相比,感染后5天感染組和乳糖封閉感染組小鼠肝臟組織IFN-ɑ/β的m RNA表達(dá)水平均顯著升高(P0.001),且乳糖封閉感染組低于感染組(P0.001);而感染后7天乳糖封閉感染組小鼠肝臟組織IFN-ɑ/β的m RNA表達(dá)水平也低于感染組(P0.05)。與正常對(duì)照組和乳糖對(duì)照組相比,感染后5和7天感染組和乳糖封閉感染組小鼠肝臟組織IFN-γ的m RNA表達(dá)水平均顯著升高,而感染后7天乳糖封閉感染組小鼠肝臟組織IFN-γ的m RNA表達(dá)水平也顯著低于感染組(P0.05)。(8)與正常對(duì)照組和乳糖對(duì)照組相比,感染后5和7天感染組和乳糖封閉感染組小鼠肝臟組織IL-6、IL-12、TNF-α和IL-10 m RNA表達(dá)水平顯著升高,且乳糖封閉感染組均高于感染組。(9)與正常對(duì)照組和乳糖對(duì)照組相比,感染組和乳糖封閉感染組小鼠肝臟組織的凋亡細(xì)胞在感染后5和7天顯著升高(P0.001);而乳糖封閉感染組小鼠的肝臟組織的凋亡細(xì)胞在感染后5和7天均高于感染組(P0.001)。3)結(jié)論乳糖封閉galectins后對(duì)比發(fā)現(xiàn),感染伯氏瘧原蟲的小鼠生存時(shí)間縮短、血蟲感染率和肝組織蟲荷量增高、肝臟組織病理損害加重;同時(shí)免疫組化染色顯示肝內(nèi)KCs數(shù)量顯著增多,免疫熒光染色顯示Tim-3+KC和Gal-9+KCs的數(shù)量明顯增多,凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增多,伴隨著Ⅰ型干擾素表達(dá)的下降,提示Tim-3/Gal-9通路作用于KCs,可能通過調(diào)節(jié)Ⅰ型干擾素的分泌參與伯氏瘧原蟲感染小鼠肝臟的免疫病理反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：伯氏瘧原蟲 肝損傷 Tim-3/Gal-9 kupffer細(xì)胞 Ⅰ型干擾素
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R531.3
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第一部分 Tim-3 和Gal-9 在伯氏瘧原蟲感染小鼠肝臟中的動(dòng)態(tài)表達(dá)18-46
• 1. 前言18-20
• 2. 材料和方法20-31
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-44
• 4. 討論44-46
• 第二部分 封閉galectins對(duì)伯氏瘧原蟲感染小鼠肝臟巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用研究46-77
• 1. 前言46-48
• 2. 材料和方法48-57
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果57-72
• 4. 討論72-77
• 全文總結(jié)77-78
• 參考文獻(xiàn)78-86
• 中英文詞匯縮略對(duì)照表86-88
• 碩士在讀期間取得的成果88-89
• 致謝89

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本文編號(hào)：657024