本文關(guān)鍵詞：人熱休克蛋白HSP70與HBVPreS1相互作用的研究

  更多相關(guān)文章： HSP70 HBV PreS1 pull down MTS ATPase活性 分泌

【摘要】：目的以HSP70與PreS1的相互作用為基礎(chǔ),以HSP70參與調(diào)控HBV病毒分泌作為研究對(duì)象,闡明HSP70在包漿內(nèi)引導(dǎo)HBV病毒顆粒向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌的機(jī)制,同時(shí)為開(kāi)發(fā)以阻斷HBV分泌的新型抗病毒藥奠定基礎(chǔ)。方法1)分子克隆技術(shù)構(gòu)建pW28-HSP70原核表達(dá)質(zhì)粒,在大腸桿菌(Eecherichia coli,E.coli)B834中獲得可溶性上清表達(dá),通過(guò)蛋白純化技術(shù)純化。分子克隆技術(shù)構(gòu)建HSP70腺病毒,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HSP70的肝癌細(xì)胞系。2)構(gòu)建PreS1截?cái)嗥钨|(zhì)粒,獲得GST-PreS1X1,GST-PreS1X2,GST-PreS1X3融合蛋白,Pull down實(shí)驗(yàn)初步探究HSP70與PreS1的結(jié)合位點(diǎn)。3)進(jìn)一步將PreS1截?cái)酁榘被釟埢?獲得GST-PreS1Δ1-13,GST-PreS1Δ1-44,GST-PreS1Δ16-27,GST-PreS1Δ21-33,GS T-PreS1-Δ21-47,GST-PreS1Δ31-47,GST-PreS1Δ41-53融合蛋白,通過(guò)微量熱泳動(dòng)技術(shù)(Microscale Thermophoresis,MST)找出在HSP70與PreS1在相互結(jié)合中發(fā)揮重要作用的位點(diǎn)。4)通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)獲得hsp70突變體,表達(dá)純化突變型蛋白�？兹妇G定磷法檢測(cè)野生型及突變型hsp70的atpase活性。5)通過(guò)qrt-pcr,westernblot檢測(cè)肝癌細(xì)胞系中hbv對(duì)hsp70的影響;檢測(cè)hsp70對(duì)hbv的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平的影響。6)通過(guò)qrt-pcr,westernblot,elisa檢測(cè)hsp70在hepg2.2.15及ad38細(xì)胞系中,對(duì)hbv分泌水平的影響。7)通過(guò)高通量測(cè)序篩選與hbv分泌相關(guān)因子探究hbv分泌相關(guān)機(jī)制。結(jié)果1)pw28-hsp70重組質(zhì)粒在e.coli中獲得可溶性上清表達(dá)。經(jīng)純化hsp70蛋白純度達(dá)85%以上。成功構(gòu)建pad-hsp70重組腺病毒,并在hepg2.2.15中穩(wěn)定表達(dá)。2)獲得純度90%以上的gst-pres1x1,gst-pres1x2,gst-pres1x3融合蛋白,pulldown實(shí)驗(yàn)證實(shí)hsp70蛋白能夠與gst-pres1x1,gst-pres1x2,gst-pres1x3蛋白分別結(jié)合。3)pres1的30-45個(gè)氨基酸殘基在與hsp70的結(jié)合中起著關(guān)鍵作用。4)獲得三種突變型hsp70蛋白,分別為mutant-thr38,mutant-thr229,mutant-ser300。野生型hsp70蛋白的atpase在37℃,tris hcl(ph8.0)等條件下具有較好的活性。野生型hsp70蛋白atpase活性顯著高于突變體,其檢測(cè)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5)qrt-pcr結(jié)果顯示,hbv可以引起hsp70mrna水平增高,western blot顯示HBV可以引起HSP70蛋白表達(dá)增加;同時(shí)HSP70可以抑制HBV的轉(zhuǎn)錄水平,HSP70降低HBV蛋白表達(dá)水平。6)qRT-PCR,western blot及ELISA結(jié)果顯示HSP70在一定程度上增加了表達(dá)HBV的肝癌細(xì)胞中HBV分泌量。7)高通量測(cè)序篩選出部分與HBV分泌相關(guān)因子。結(jié)論P(yáng)reS1的30-45氨基酸在與HSP70的結(jié)合過(guò)程中發(fā)揮重要作用;HSP70具有ATPase活性;HSP70能夠介導(dǎo)HBV分泌。
【關(guān)鍵詞】：HSP70 HBV PreS1 pull down MTS ATPase活性 分泌
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.62
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一章 熱休克蛋白家族HSP70蛋白表達(dá)，純化及其與HBV的Pre S1的相互作用14-42
• 第一節(jié) HSP70的克隆，表達(dá)，，純化15-26
• 1 材料與方法15-22
• 2 結(jié)果22-24
• 3 討論24-26
• 第二節(jié) Pre S1截?cái)嗥闻cHSP70的結(jié)合實(shí)驗(yàn)26-31
• 1 材料與方法26-28
• 2 結(jié)果28-30
• 3 討論30-31
• 第三節(jié) HSP70的ATP酶活性檢測(cè)31-40
• 1 材料與方法31-36
• 2 結(jié)果36-38
• 3 討論38-40
• 參考文獻(xiàn)40-42
• 第二章 HSP70介導(dǎo)HBV分泌的研究42-71
• 第一節(jié) 過(guò)表達(dá)HSP70腺病毒的構(gòu)建42-49
• 1 材料與方法42-45
• 2 結(jié)果45-48
• 3 討論48-49
• 第二節(jié) HSP70在HBV復(fù)制過(guò)程中的相關(guān)研究49-57
• 1 材料和方法49-52
• 2 結(jié)果52-55
• 3 討論55-57
• 第三節(jié) HSP70在HBV分泌過(guò)程中的相關(guān)研究57-68
• 1 材料與方法57-60
• 2 結(jié)果60-66
• 3 討論66-68
• 參考文獻(xiàn)68-71
• 全文總結(jié)71-73
• 文獻(xiàn)綜述73-80
• 參考文獻(xiàn)76-80
• 致謝80-81
• 發(fā)表的論文、參加的學(xué)術(shù)會(huì)議及參與的科研項(xiàng)目81

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 徐倩倩;張小敏;景嬌;師保浚;王世旗;周斌;陳溥言;;熱休克蛋白70促進(jìn)豬瘟病毒囊膜糖蛋白E0的小鼠免疫效果[J];病毒學(xué)報(bào);2015年04期

本文編號(hào)：654082