發(fā)布時(shí)間：2017-08-10 22:22

  本文關(guān)鍵詞：基于超高速離心濃縮技術(shù)的HBV低載量樣本檢測體系的初步研究

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【摘要】：背景和目的：乙肝病毒是我國主要的輸血傳播病原體之一。雖然目前在全國統(tǒng)一開展了核酸檢測措施,但仍然存在一定的殘余風(fēng)險(xiǎn)。主要因?yàn)椴糠肢I(xiàn)血者體內(nèi)病毒載量極低,低于常用的多人份混樣檢測試劑的靈敏度,加之目前大部分進(jìn)口試劑的設(shè)計(jì)不太適合國內(nèi)的病毒流行株。針對目前出現(xiàn)的問題,本文主要目的是初步研究適合中國流行特征的HBV低載量樣本的篩查/定量檢測體系。方法：1、選定磁珠法提取體系的成分,通過正交設(shè)計(jì)表初步確定其濃度或酸堿度,主要包括GuSCN、蛋白酶K、異丙醇及PH;固定其它因素,優(yōu)化單一成分濃度,最終確定提取體系各成分濃度：選擇4種廠家的硅基磁珠,比較不同磁珠的提取效果；確定磁珠種類后,優(yōu)化磁珠用量。確定提取體系后與成品化提取試劑盒(包括QlAamp(?)DNA Blood Mini Kit及MagPure Viral DNA/RNA Mini KF Kit)進(jìn)行比較。2、在NCBI的Nucleotide中輸入HBV、China、complete genome等關(guān)鍵詞找到中國地區(qū)的HBV序列,經(jīng)比對后在保守序列設(shè)計(jì)引物探針,引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)PMD-19載體連接制備成質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并測序驗(yàn)證序列,計(jì)算質(zhì)�？截悢�(shù),并稀釋成不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,購買第三方標(biāo)準(zhǔn)品對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校正,繪制HBV標(biāo)準(zhǔn)曲線,并用Probit分析計(jì)算檢測下限,驗(yàn)證靈敏度、特異性等。將建立好的HBV熒光定量檢測方法檢測100例樣本,并與羅氏cobas(?)TaqScreen MPX Test, version 2.0檢測試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。3、用HBV陰性血漿稀釋HBV標(biāo)準(zhǔn)品,制成低拷貝樣本：固定離心時(shí)間,研究不同離心力與病毒回收率的關(guān)系：固定離心力,研究離心時(shí)間對回收率的影響：最后使用低載量樣本對超高速濃縮技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證并評估其應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果：1、提取體系的優(yōu)化結(jié)果：GuSCN濃度2.0M,蛋白酶K濃度為0.89mg/ml,異丙醇35%,PH為8；磁珠的選擇：A磁珠；磁珠用量：30ul。建立的磁珠提取系統(tǒng)在高、中、低三個(gè)濃度的提取效率與兩種試劑盒比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2、建立的HBV檢測體系引物探針特異性好,質(zhì)粒測序結(jié)果完全吻合,標(biāo)準(zhǔn)品曲線R20.999,擴(kuò)增效率為92.75%,線性范圍為5.0x101-2.5x109IU/mL,95%檢測下限為16.2IU/mL,批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)為0.15%-1.11%,批間變異系數(shù)為0.91%-4.67%。與羅氏檢測結(jié)果相關(guān)關(guān)系為y=0.916x+2.186,(R=0.96；P0.001)3、當(dāng)離心力在15000g-90800g時(shí),HBV病毒回收率從41.43%增加至88.29%；當(dāng)離心力在為90800g-138900g時(shí),HBV病毒回收率相對穩(wěn)定在80%-90%之間;當(dāng)離心力在138900g-171000g時(shí),HBV病毒回收率從88.29%下降至62.94%。離心時(shí)間為0.5h、1h、1.5h及2h時(shí),其回收分別為88.31%、89.70%、88.40%、75.62%。運(yùn)用濃縮技術(shù)后,發(fā)現(xiàn)8例cobas(?)TaqScreen MPX Test,version 20漏檢樣本。11、將超高速離心濃縮技術(shù)與本實(shí)驗(yàn)建立的HBV檢測體系結(jié)合時(shí),單個(gè)樣本取樣量不少于2ml時(shí)(N人份混檢時(shí),每個(gè)樣本取2ml混合,共N*2ml),離心濃縮后靈敏度可達(dá)2IU/mL;單個(gè)樣本取樣量不少于4ml時(shí)(N人份混檢時(shí),每個(gè)樣本取4ml混合,共N*4ml),靈敏度可達(dá)1IU/mL。結(jié)論：1、通過優(yōu)化提取試劑成分及濃度,成功建立起實(shí)驗(yàn)室血漿HBV病毒核酸的磁珠提取體系。2、建立了適合中國HBV病毒流行特征的HBV熒光定量檢測體系。3、建立了基于超高速離心濃縮的HBV檢測方法,提高病毒檢出率。
【關(guān)鍵詞】：HBV 磁珠法核酸提取 熒光定量PCR 超高速離心 病毒濃縮
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.62;R446.6
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 引言10-12
• 第一章：磁珠法提取血漿HBV核酸的體系建立12-27
• 1. 前言12-13
• 2. 材料與方法13-19
• 2.1 材料13-14
• 2.2 方法14-19
• 3. 結(jié)果19-25
• 3.1 磁珠法提取血漿HBV病毒實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果19-24
• 3.2 磁珠提取方法與商品化提取試劑盒的比較結(jié)果24-25
• 4. 討論25-27
• 第二章：特異性引物及探針的篩選、HBV熒光定量PCR檢測方法的建立、與商品化試劑盒的比較27-38
• 1. 前言27-28
• 2. 材料與方法28-31
• 2.1 材料28
• 2.2 方法28-31
• 3. 結(jié)果31-35
• 3.1 HBV引物的特異性31
• 3.2 重組質(zhì)粒的擴(kuò)增結(jié)果及測序驗(yàn)證31-32
• 3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制32
• 3.4 重復(fù)性評價(jià)32-33
• 3.5 最低檢測線(LOD)的確立33
• 3.6 靈敏度的驗(yàn)證33
• 3.7 臨床特異性的驗(yàn)證33-34
• 3.8 與羅氏cobas(?)TaqScreen MPX Test,version 2.0檢測試劑盒的性能比較34-35
• 4. 討論35-38
• 第三章：超高速離心技術(shù)濃縮HBV病毒的效果及應(yīng)用38-51
• 1. 前言38-39
• 2. 材料與方法39-42
• 2.1 材料39
• 2.2 方法39-42
• 3. 結(jié)果42-47
• 3.1 不同離心力的檢測結(jié)果及回收率(%)42-45
• 3.2 不同離心時(shí)間的檢測結(jié)果及回收率(%)45
• 3.3 超高速離心濃縮后的靈敏度驗(yàn)證結(jié)果45-46
• 3.4 4例漏檢樣本的驗(yàn)證結(jié)果46
• 3.5 42例HbsAg陰性、Anti-HBc陽性、NAT陰性樣本濃縮前后對比結(jié)果46-47
• 4. 討論47-51
• 第四章: 結(jié)論51-52
• 參考文袱52-56
• 文獻(xiàn)綜述 核酸提取方法的進(jìn)展56-68
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 已發(fā)表文章68-69
• 致謝69-70

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：652996