本文關(guān)鍵詞：環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)檢測鉤端螺旋體方法的建立、應(yīng)用和評價

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【摘要】：鉤端螺旋體病(leptospirosis,簡稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)感染引起的全球性人獸共患傳染病,流行范圍廣,危害大。在我國,多發(fā)生于水稻種植區(qū)域,是洪澇災(zāi)害時重點監(jiān)控的傳染病之一。鉤端螺旋體屬分兩個種：問號鉤端螺旋體和雙曲鉤端螺旋體；前者是寄生性、致病性的問號鉤端螺旋體,可分離自病人、動物或者帶菌者；后者是非致病性鉤端螺旋體,通常對人和動物不致病,除少數(shù)菌株外均來自地表水。鉤體病的早期診斷對于鉤體病的治療和預(yù)后很重要,目前診斷鉤體的方法有鉤體菌分離培養(yǎng)法、經(jīng)典方法顯微凝集試驗(microscopic agglutination test, MAT)、動物接種以及分子生物學(xué)技術(shù)檢查等。各種方法均具有一定的優(yōu)缺點和適用性,例如,分離培養(yǎng)耗費時間長、檢出陽性率低；MAT具有快速和靈敏的特點,但該檢測方法存在一定的局限性,如耗費血清抗體量大、檢測時效性低、結(jié)果易受各種因素影響等；PCR和熒光定量PCR存在操作復(fù)雜和儀器昂貴等問題,在一些發(fā)展中國家和現(xiàn)場檢測方面受到限制。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是2000年日本榮研公司Notomi博士研發(fā)出的一種新型等溫核酸擴(kuò)增方法。本研究旨在建立環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)快速檢測鉤端螺旋體,并應(yīng)用于鉤體的現(xiàn)場環(huán)境檢測,為鉤體病原菌的快速檢測、現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查和現(xiàn)場疾病監(jiān)測提供基礎(chǔ)。本研究實驗中的LipL32是鉤體外膜重要蛋白,僅存在致病性鉤體中,含量占的外膜總蛋白75%,是引起人和動物免疫的重要蛋白。本研究以鉤體外膜蛋白LipL32基因為目的基因,下載我國15群15型鉤體標(biāo)準(zhǔn)參考菌株序列,設(shè)計LAMP引物,并以熒光定量PCR和普通PCR為對照,依次進(jìn)行菌株樣本靈敏度檢測、特異性檢測(98株菌)、模擬樣本研究和現(xiàn)場實踐研究(69個樣本)。結(jié)果：探針法熒光定量PCR檢測下限為2copy/μL; LAMP檢測下限為200 copy/μL,同染料法熒光定量檢測下限一樣,比普通PCR方法靈敏100倍；特異性檢驗結(jié)果良好,擴(kuò)增56株鉤體結(jié)果為陽性,檢測25株非鉤體結(jié)果為陰性；模擬樣本檢測下限為200條鉤體/μL(煮沸法)和200條鉤體/μL(試劑盒提取法)。在現(xiàn)場采集標(biāo)本檢測研究中,不同的檢測方法的結(jié)果一致,LAMP對現(xiàn)場采集標(biāo)本的檢出率同熒光定量法一致,高于普通PCR方法。本次LAMP研究,針對致病性鉤體LipL32基因設(shè)計的引物,特異性好,靈敏度比普通PCR高兩個數(shù)量級,可以應(yīng)用于不同血清型、群的鉤體檢測,也可以用于現(xiàn)場采集標(biāo)本的檢測。LAMP實驗操作簡單,對設(shè)備要求不高,可以用于現(xiàn)場快速檢測鉤體。
【關(guān)鍵詞】：問號鉤端螺旋體屬 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增 檢測 應(yīng)用
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R514.4;R440
【目錄】：

• 縮略詞5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-26
• 材料與方法26-36
• 結(jié)果及分析36-53
• 討論53-59
• 小結(jié)59-60
• 參考文獻(xiàn)60-62
• 附件62-68
• 碩士研究生期間發(fā)表文章68-69
• 致謝69

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