本文關(guān)鍵詞：體外研究miR-155在HBV慢性感染中的抗病毒免疫作用

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【摘要】：目的：研究miR-155在HBV慢性感染的細(xì)胞模型中對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)及其抗HBV作用。方法：1.提取人肝癌細(xì)胞株總DNA作為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增miR-155前體序列,酶切后退火連接到pmR-mCherry質(zhì)粒,構(gòu)建pmiR-155真核表達(dá)載體,然后進(jìn)行菌落PCR、質(zhì)粒雙酶切和DNA測(cè)序鑒定。2.利用脂質(zhì)體法將pmiR-155真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2.2.15細(xì)胞,同時(shí)設(shè)空載組(pmR-mCherry質(zhì)粒)、轉(zhuǎn)染試劑組、空白組和對(duì)照組(HepG2細(xì)胞)。轉(zhuǎn)染后24 h熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)紅色熒光蛋白的表達(dá)情況,熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)miR-155表達(dá)量。3.重組質(zhì)粒pmiR-155經(jīng)去內(nèi)毒素提取后,轉(zhuǎn)染到人肝癌細(xì)胞株。收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液,應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)各組SOCS-1 mRNA的變化,Western Blot檢測(cè)各組SOCS-1蛋白的變化,ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞的IFN-Y及IL-2的分泌量變化。4.重組質(zhì)粒pmiR-155轉(zhuǎn)染到HepG2.2.15細(xì)胞,同時(shí)設(shè)空載組(pmR-mCherry質(zhì)粒)、轉(zhuǎn)染試劑組、空白組。轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h,應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)miR-155表達(dá)量,化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液HBsAg和HBeAg變化,熒光實(shí)時(shí)定量PCR定量檢測(cè)HBV DNA拷貝數(shù)的變化。結(jié)果：1.通過(guò)菌落PCR、質(zhì)粒雙酶切及DNA測(cè)序鑒定,證實(shí)miR-155前體序列成功插入pmR-mcherry真核表達(dá)載體,pmiR-155真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。2.轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h各組細(xì)胞進(jìn)行熒光觀察,載體中紅色熒光蛋白有較好的表達(dá),轉(zhuǎn)染效率達(dá)到50%以上。熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明,以空白組為基準(zhǔn),重組載體組細(xì)胞內(nèi)所表達(dá)的miR-155明顯增加,具有顯著意義(P0.05)。3. RT-PCR結(jié)果示：重組載體組SOCS-1 mRNA的表達(dá)量(0.63±0.09)顯著低于空白組(P0.05)；Western Blot結(jié)果示：重組載體組內(nèi)SOCS-1蛋白表達(dá)量(0.37±0.07)顯著低于空白組(P0.05)；ELISA結(jié)果示：以空白組為基準(zhǔn),重組載體組與對(duì)照組所分泌的IFN-γ、IL-2水平均顯著高于空白組(P0.05),而空載組及轉(zhuǎn)染試劑組與空白組相似。4.化學(xué)發(fā)光法結(jié)果示：以空白組為基準(zhǔn),轉(zhuǎn)染后重組載體組細(xì)胞所分泌HBsAg、HBeAg明顯減少,而空載組及轉(zhuǎn)染試劑組與空白組相似。轉(zhuǎn)染后48h重組載體細(xì)胞內(nèi)miR-155對(duì)HBsAg和HBeAg抑制最為明顯,抑制率分別為(83.96±1.52)%和(79.60±8.71)%。熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果示：轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h,以空白組為基準(zhǔn),重組載體組中HBV DNA拷貝數(shù)明顯減少,而空載組及轉(zhuǎn)染試劑組未見(jiàn)明顯差異。其中重組載體組內(nèi)miR-155對(duì)HBV DNA的抑制率分別為(51.87±0.36)%、(43.67±1.51)%和(68.21±6.02)%。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)miR-155與HBsAg、HBeAg和HBV DNA表達(dá)復(fù)制呈負(fù)相關(guān)(r0)。結(jié)論：在HBV慢性感染的細(xì)胞模型HepG2.2.15中,過(guò)表達(dá)的miR-155可通過(guò)增強(qiáng)抗病毒免疫效應(yīng)抑制HBV的復(fù)制及表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒 微小核糖核酸155 細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1 干擾素-γ 白細(xì)胞介素-2
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.62
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 引言10-12
• 第一章 文獻(xiàn)研究12-20
• 1.1 HBV的流行病學(xué)12-15
• 1.1.1 HBV的病原學(xué)12-13
• 1.1.2 HBV的生命周期13-14
• 1.1.3 HBV與免疫耐受14-15
• 1.1.4 HBV的藥物治療15
• 1.2 RNA干擾15-18
• 1.2.1 siRNA16
• 1.2.2 miRNA16-18
• 1.3 小結(jié)18-20
• 第二章 MIR-155真核表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定及表達(dá)20-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-23
• 2.1.1 細(xì)胞系20
• 2.1.2 菌株與質(zhì)粒20
• 2.1.3 主要試劑及試劑盒20-21
• 2.1.4 主要溶液的配制21-22
• 2.1.5 主要儀器22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-32
• 2.2.1 HepG2.2.15細(xì)胞基因組DNA提取23-24
• 2.2.2 pmiR-155真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建24-28
• 2.2.3 pmiR-155真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定28-29
• 2.2.4 pmiR-155真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)29-32
• 2.2.5 統(tǒng)計(jì)分析32
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-40
• 2.3.1 pmiR-155真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定32-35
• 2.3.2 細(xì)胞內(nèi)熒光檢測(cè)35-36
• 2.3.3 pmiR-155真核表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)36-40
• 2.4 討論40-43
• 2.4.1 人miR-155真核表達(dá)載體構(gòu)建成功40-41
• 2.4.2 重組載體pmiR-155提高細(xì)胞內(nèi)miR-155表達(dá)量41-43
• 第三章 MIR-155在HBV慢性感染中調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答作用43-61
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料43-45
• 3.1.1 細(xì)胞系及質(zhì)粒43
• 3.1.2 主要試劑及試劑盒43-44
• 3.1.3 主要溶液的配制44
• 3.1.4 主要儀器44-45
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法45-51
• 3.2.1 預(yù)測(cè)人miR-155靶基因位點(diǎn)45
• 3.2.2 RT-PCR檢測(cè)各組SOCS-1 mRNA變化45-46
• 3.2.3 Western blot檢測(cè)各組SOCS-1蛋白變化46-49
• 3.2.4 ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞IFN-γ分泌量變化49-50
• 3.2.5 ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞IL-2分泌量變化50-51
• 3.2.6 統(tǒng)計(jì)分析51
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-58
• 3.3.1 SOCS-1是miR-155的靶位點(diǎn)51-52
• 3.3.2 miR-155抑制SOCS-1 mRNA表達(dá)52-54
• 3.3.3 miR-155抑制SOCS-1蛋白表達(dá)54-55
• 3.3.4 miR-155促進(jìn)IFN-γ和IL-2分泌55-56
• 3.3.5 miR-155與SOCS-1 mRNA和細(xì)胞因子的相關(guān)性分析56-58
• 3.4 討論58-61
• 3.4.1 miRNA的免疫調(diào)節(jié)作用及其對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞中IFN-γ、IL-2的影響58-59
• 3.4.2 miR-155干預(yù)SOCS-1對(duì)IFN-γ、IL-2的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用59-61
• 第四章 MIR-155對(duì)HBV復(fù)制及表達(dá)的影響61-70
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料61-62
• 4.1.1 細(xì)胞系及質(zhì)粒61
• 4.1.2 主要試劑及試劑盒61
• 4.1.3 主要儀器61-62
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法62-64
• 4.2.1 人miR-155序列RT-qPCR擴(kuò)增62
• 4.2.2 乙型肝炎病毒表面抗原定量檢測(cè)62
• 4.2.3 乙型肝炎病毒e抗原定量檢測(cè)62-63
• 4.2.4 乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)63-64
• 4.2.5 統(tǒng)計(jì)分析64
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果64-68
• 4.3.1 miR-155對(duì)HBsAg和HBeAg的抑制作用64-66
• 4.3.2 miR-155對(duì)HBV DNA的抑制作用66-67
• 4.3.3 miR-155和HBV蛋白和HBV DNA的相關(guān)性分析67-68
• 4.4 討論68-70
• 4.4.1 HepG2.2.15細(xì)胞與HBV69
• 4.4.2 miR-155抑制HBV的可能機(jī)制69-70
• 結(jié)語(yǔ)70-72
• 參考文獻(xiàn)72-77
• 附錄77-83
• 在校期間發(fā)表論文情況83-84
• 致謝84

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

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本文編號(hào)：622826