發(fā)布時間：2017-08-04 04:25

  本文關(guān)鍵詞：蜱傳腦炎病毒診斷抗原的篩選及LIPS檢測技術(shù)的優(yōu)化

  更多相關(guān)文章： TBEV LIPS E蛋白胞外區(qū) 穩(wěn)定細(xì)胞系 Nanoluc

【摘要】：蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)是黃病毒科黃病毒屬的一種烈性病毒,主要通過蜱蟲叮咬傳播,可引起嚴(yán)重的臨床癥狀,威脅人類的健康和社會安定。蜱傳腦炎病毒主要有歐洲型、西伯利亞型和遠(yuǎn)東型三種亞型,我國主要為遠(yuǎn)東型TBEV,致死率約為20%,因此蜱傳腦炎病毒感染的臨床診斷對疾病的控制和治療有重要意義。TBEV病毒的基因組是由單股正鏈RNA構(gòu)成的,共編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白和七種非結(jié)構(gòu)蛋白,其中的包膜糖蛋白(E蛋白)由496個氨基酸構(gòu)成,包含了天然病毒90%的抗原中和表位,是TBEV感染的檢測抗原的首選。目前對TBEV感染血清學(xué)檢測的抗原,既有通過病毒培養(yǎng)獲得的全病毒抗原,也有通過體外表達(dá)獲得的胞膜糖蛋白片段。本研究表達(dá)了含有較多抗原表位的完整E蛋白胞外區(qū),評價了其在TBEV感染血清檢測中的效果,并優(yōu)化了TBEV感染血清檢測的一種新型的血清學(xué)檢測技術(shù)-熒光素酶免疫共沉淀(Luciferase immunoprecipitation system,LIPS)。熒光素酶免疫共沉淀是將熒光素酶基因與抗原基因共表達(dá),并由真核表達(dá)系統(tǒng)制備檢測抗原,通過檢測抗原-抗體-瓊脂糖凝珠混合物中的熒光素酶活性來判斷待檢樣品中的抗體含量。該方法具有檢測靈敏性高、操作簡單快捷等優(yōu)點。本研究的主要內(nèi)容如下:一 TBEV包膜糖蛋白胞外區(qū)密碼子的優(yōu)化、表達(dá)及檢測效果評價首先本研究對TBEV包膜糖蛋白(E蛋白)的抗原結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析,選用TBEV-MDJ01株的E蛋白胞外區(qū)(EC)作為TBEV感染血清的檢測抗原,并通過LIPS方法評價其檢測效果。通過www.jcat.de對EC原始基因序列進(jìn)行真核密碼子優(yōu)化,由基因合成優(yōu)化的胞外區(qū)基因序列(OPT-EC)。將抗原基因與Rluc(Renilla luciferase)基因進(jìn)行融合構(gòu)建重組質(zhì)粒,瞬時轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞獲得重組抗原Rluc-OPT-EC和Rluc-EC。比較優(yōu)化基因和原始基因的表達(dá)量的差異,并將重組抗原用于臨床感染血清樣本的免疫共沉淀檢測(LIPS),以評價抗原的靈敏性和特異性。對獲得的重組抗原Rluc-OPT-EC和Rluc-EC的熒光活性檢測結(jié)果顯示,真核密碼子優(yōu)化后的胞外區(qū)基因(Rluc-OPT-EC)的表達(dá)量約是原始基因序列Rluc-EC的12倍。將重組抗原Rluc-OPT-EC用于TBEV感染血清的LIPS檢測,OPT-EC的檢測靈敏度可以達(dá)到86%以上,其對乙型腦炎病毒(JEV)感染血清、黃熱病毒(YFV)感染血清、流感病毒(AIV)感染血清和正常人血清的檢測特異度高于90%,但是在西尼羅病毒(WNV)感染血清和登革病毒(DENV)感染血清的檢測中存在交叉反應(yīng)。實驗證明真核密碼子優(yōu)化能夠有效地提高外源蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量,且優(yōu)化后的e蛋白胞外區(qū)蛋白作為tbev感染的檢測抗原,能夠有效地區(qū)分jev、yfv感染,但是不能區(qū)分于wvn和dv感染。二 新型lips檢測技術(shù)的建立和優(yōu)化1 構(gòu)建表達(dá)tbev檢測抗原的穩(wěn)定細(xì)胞系lips檢測中真核表達(dá)抗原是通過瞬時轉(zhuǎn)染的方法制備的,存在實驗時間長、檢測抗原不穩(wěn)定且需重復(fù)制備等問題,為了進(jìn)一步優(yōu)化抗原的制備方法,本研究采用慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染系統(tǒng),通過將rluc-ve3和rluc-opt-ec融合基因插入慢病毒載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒,再將重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞獲得慢病毒包裝顆粒。該慢病毒包裝顆粒能夠感染真核細(xì)胞,通過感染cos7細(xì)胞,慢病毒將自身基因組整合到細(xì)胞基因組中,經(jīng)過rfp和嘌呤素酶篩選,由單克隆細(xì)胞分裂獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞株,并對細(xì)胞株的外源蛋白表達(dá)進(jìn)行驗證,分別對其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行海腎熒光素酶活性檢測和tbev感染血清檢測。經(jīng)單克隆篩選獲得的穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞株,細(xì)胞株具備表達(dá)紅色熒光蛋白和嘌呤素酶抗性,初步說明慢病毒基因組已整合到細(xì)胞基因組中,進(jìn)一步通過檢測海腎熒光素酶和抗原的表達(dá)對細(xì)胞株進(jìn)行驗證。實驗結(jié)果顯示,穩(wěn)定細(xì)胞株的細(xì)胞裂解液中,能夠檢測到海腎熒光素酶活性,rluc-ve3的熒光強(qiáng)度為5.14×106lu,rluc-opt-ec的熒光強(qiáng)度為4.29×105lu,rluc-ve3的表達(dá)量高于rluc-ort-ec,分析原因可能是由于rluc-ort-ec的分子量較大,從而影響其表達(dá)量。對穩(wěn)定表達(dá)的重組抗原rluc-ve3進(jìn)行l(wèi)ips檢測,以判斷其是否表達(dá)有ve3抗原。結(jié)果表明重組抗原rluc-ve3在19份tbev感染血清中,檢測出13份陽性,檢測靈敏度為76.47%(**p0.01),而在實驗室前期工作中,通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染制備的rluc-ve3的tbev陽性檢出率79.2%,穩(wěn)定表達(dá)抗原的檢出率與該結(jié)果相近,說明構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系cos7-rluc-ve3表達(dá)的重組抗原rluc-ve3可用于tbev感染血清的lips檢測。本研究中構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)檢測抗原的細(xì)胞系,簡化了抗原制備的方法,降低了實驗成本、操作時間,能夠持續(xù)穩(wěn)定的為tbev感染血清的檢測提供診斷抗原。2 檢測標(biāo)記物的優(yōu)化-以更為穩(wěn)定的nanoluc代替rluc在實驗操作中,研究發(fā)現(xiàn)renillaluciferase的熱穩(wěn)定性不好,在37℃環(huán)境中,其熒光素酶活性的半衰期只有10min,在以往的實驗中采用的均是室溫孵育,而抗原抗體的最佳結(jié)合條件是37℃,在該溫度條件下可縮短抗原抗體的結(jié)合時間,從而使檢測更加快速。為了改善renillaluciferase對環(huán)境溫度的限制,選擇了新型的基因工程改造酶nanoluciferase作為lips檢測中的標(biāo)記蛋白,nanoluciferase具備分子量小、熒光信號強(qiáng)且?guī)в蠳-末端分泌信號等優(yōu)勢,可使真核表達(dá)抗原的制備從原來收集細(xì)胞裂解液,改善為收集細(xì)胞上清液,減少抗原中的雜蛋白成分,提高檢測靈敏性。將Nanoluc基因與抗原基因共表達(dá),制備重組抗原Nanoluc-VE3,并對該抗原的熒光素酶活性、熱穩(wěn)定性和作為檢測抗原的檢測效果進(jìn)行實驗。實驗結(jié)果表明,成功制備了Nanoluc-VE3重組抗原,從Nanoluc-VE3和Rluc-VE3的熱穩(wěn)定性結(jié)果看出,Nanoluc-VE3在37℃和室溫條件下,隨時間的延長其熒光強(qiáng)度并沒有明顯變化,說明Nanoluc在37℃和室溫的穩(wěn)定性均良好。對Nanoluc-VE3和Rluc-VE3熒光素酶活性的檢測中,Nanoluc-VE3的熒光強(qiáng)度為7.79×109LU,而Rluc-VE3的熒光強(qiáng)度為6.71×106LU,Nanluc-VE3的熒光信號要明顯高于Rluc-VE3的熒光信號強(qiáng)度。將Nanoluc-VE3作為檢測抗原用于TBEV感染血清的LIPS檢測,對30份TBEV感染血清的檢測中共檢出28份陽性,表明Nanoluc-VE3能夠作為檢測抗原應(yīng)用于TBEV感染血清的LIPS檢測,在此基礎(chǔ)上,重新構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)重組抗原Nanluc-VE3的穩(wěn)定細(xì)胞株,該細(xì)胞株能夠持續(xù)穩(wěn)定的向胞外分泌重組抗原Nanluc-VE3,并將其應(yīng)用于感染血清的檢測。穩(wěn)定表達(dá)的Nanluc-VE3對30份TBEV感染血清的檢測靈敏度為93.33%,該檢測結(jié)果高于Rluc-VE3對TBEV感染血清的檢測靈敏度(76.47%),說明Nanoluc-VE3的檢測信號靈敏度更高,胞外表達(dá)的抗原雜蛋白少,檢測精準(zhǔn)度更高。對JEV和DV感染血清的檢測特異性為100%,說明通過穩(wěn)定細(xì)胞系制備的重組抗原Nanoluc-VE3能夠用于LIPS檢測,因此本部分實驗為LIPS檢測提供新型的熒光蛋白標(biāo)簽。本研究評價了E蛋白胞外區(qū)作為TBEV感染血清檢測抗原的檢測效果,為TBEV血清學(xué)檢測的抗原篩選提供了重要的實驗依據(jù)。并優(yōu)化了用于TBEV血清檢測的熒光素酶-免疫沉淀技術(shù),采用更為穩(wěn)定、靈敏的Nano Luc熒光作為標(biāo)記物,制備了穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞系,可使抗原-熒光素酶分泌型表達(dá),使LIPS檢測方法更省時更簡便。本研究的開展對制備蜱傳腦炎病毒感染血清學(xué)快速檢測試劑具有重要價值。
【關(guān)鍵詞】：TBEV LIPS E蛋白胞外區(qū) 穩(wěn)定細(xì)胞系 Nanoluc
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R512.3;R446.6
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-16
• 第一部分 TBEV包膜糖蛋白胞外區(qū)密碼子的優(yōu)化、表達(dá)及檢測效果評價16-38
• 1 材料與方法16-30
• 1.1 材料16-20
• 1.2 實驗方法20-30
• 2 實驗結(jié)果30-35
• 2.1 TBEV包膜糖蛋白胞外區(qū)基因的真核密碼子優(yōu)化30-32
• 2.2 PCDNA3.1(+)-RLUC重組質(zhì)粒的構(gòu)建32
• 2.3 重組質(zhì)粒PCDN A3.1(+)-RLUC-EC和PCDN A3.1(+)-RLUC-OPT-EC的構(gòu)建32-33
• 2.4 重組抗原的熒光素酶活性檢測33-34
• 2.5 RLUC-OPT-EC重組抗原對TBEV感染血清的檢測34-35
• 3 討論35-38
• 第二部分 構(gòu)建表達(dá)TBEV檢測抗原的穩(wěn)定細(xì)胞系38-50
• 1 材料與方法38-44
• 1.1 材料與儀器38-39
• 1.2 實驗方法39-44
• 2 實驗結(jié)果44-48
• 2.1 重組質(zhì)粒PCDH-RLUC-OPT-EC和PCDH-RLUC-VE3的構(gòu)建44-45
• 2.2 慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞45
• 2.3 慢病毒感染COS7細(xì)胞45-46
• 2.4 穩(wěn)定細(xì)胞系COS7-RLUC-OPT-EC和COS7-RLUC-VE3的鑒定46-47
• 2.5 穩(wěn)定細(xì)胞表達(dá)的RLUC-VE3重組抗原的TBEV感染血清的LIPS檢測47-48
• 3 討論48-50
• 第三部分 NANOLUC為檢測標(biāo)簽的LIPS檢測方法的建立50-59
• 1 材料與方法50-52
• 1.1 材料與儀器50
• 1.2 實驗方法50-52
• 2 實驗結(jié)果52-57
• 2.1 重組質(zhì)粒PCDN A3.1(+)-NANOLUC-VE3、PCDH-NANOLUC-VE3的構(gòu)建52
• 2.2 重組抗原NANOLUC-VE3的制備及檢測效果評價52-55
• 2.3 穩(wěn)定表達(dá)NANOLUC-VE3的C HO-K1細(xì)胞系的構(gòu)建55-57
• 3 討論57-59
• 總結(jié)59-60
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 個人簡歷64-65
• 致謝65

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3 鄭e，

本文編號：617752