發(fā)布時間：2017-07-27 06:09

  本文關(guān)鍵詞：環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法快速檢測艱難梭菌毒素基因

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【摘要】：研究背景艱難梭菌(Clostridium difficile, C.difficile)是革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌,本身無侵襲性。當(dāng)機(jī)體腸道內(nèi)環(huán)境受到破壞時,部分產(chǎn)毒性艱難梭菌通過分泌毒素A、B以及二元毒素引起抗生素相關(guān)性腹瀉、結(jié)腸炎甚至偽膜性腸炎,統(tǒng)稱為艱難梭菌感染(C.difficile infection, CDI)。據(jù)報道,隨著艱難梭菌高毒力菌株(BI/NAP1/027型)的出現(xiàn),艱難梭菌感染的發(fā)病率和死亡率均顯著升高,引起全球的關(guān)注。艱難梭菌A、B毒素艱難梭菌可分為產(chǎn)毒株和不產(chǎn)毒株,不產(chǎn)毒株不引起臨床癥狀。艱難梭菌產(chǎn)毒株主要分泌毒素A和毒素B,分別由tcdA和tcdB編碼。毒素A又稱腸毒素,容易使腸壁中性粒細(xì)胞浸潤,釋放淋巴因子,引起機(jī)體液體大量分泌和出血性壞死；毒素B又稱細(xì)胞毒素,能使肌動蛋白解聚,損壞細(xì)胞骨架,導(dǎo)致細(xì)胞固縮壞死,直接損傷腸壁細(xì)胞。毒素B的毒力較毒素A強(qiáng)10倍。目前,已發(fā)現(xiàn)毒素A陰性、毒素B陽性的菌株；而毒素A陽性,毒素B陰性的菌株尚未被發(fā)現(xiàn),表明毒素B可以單獨(dú)致病。隨著艱難梭菌感染的暴發(fā)性流行,艱難梭菌感染快速而敏感的實驗室檢測對于疾病感染的控制和臨床診治顯得尤其重要。而選擇tcdA和tcdB作為檢測艱難梭菌的目的基因,能全面、特異的鑒定臨床產(chǎn)毒株型艱難梭菌。目前,糞便中艱難梭菌檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”是細(xì)胞毒素中和試驗(C.difficile cytotoxin neutralization assay, CCNA)及艱難梭菌產(chǎn)毒培養(yǎng)(Toxigenic culture,TC),但因培養(yǎng)條件苛刻、技術(shù)要求高、操作復(fù)雜及耗時,難以用于臨床艱難梭菌的常規(guī)檢測。利用酶聯(lián)免疫試驗(Enzyme immunoassay, EIA)則特異、快速,不敏感；而乳膠凝集試驗(Glutaimte dehydrogenase, GDH)則敏感、快速,但該方法存在交叉反應(yīng)、假陽性率高,特異性差等缺點(diǎn)。國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的普通PCR則因?qū)嶒瀮x器要求高、操作繁瑣、耗時,擴(kuò)增完成后,仍需要通過對產(chǎn)物進(jìn)行電泳、顯影等步驟判讀結(jié)果,不適合各地基層醫(yī)院及現(xiàn)場快速檢測使用。因此,尋找快速、特異、敏感的艱難梭菌檢測方法是艱難梭菌感染研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)。艱難梭菌二元毒素在歐洲和北美洲引起廣泛暴發(fā)流行的艱難梭菌高毒力菌株(BI/NAP1/027型)除分泌毒素A和毒素B外,還分泌毒力更強(qiáng)的二元毒素(C.difficile binary toxin, CDT)。CDT由致病性決定區(qū)外的2個染色體基因cdtA和cdtB編碼。cdtA是一種ADP核糖轉(zhuǎn)移酶,通過阻斷肌動蛋白片段的合成,誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞死亡。cdtB是一種運(yùn)輸?shù)鞍?被絲氨酸蛋白酶激活后,cdtB通過與宿主細(xì)胞結(jié)合,把cdtA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞液中,誘導(dǎo)細(xì)胞骨架解聚,生成微管突出物,增強(qiáng)艱難梭菌的定植。因BI/NAP1/027型艱難梭菌的tcdC基因缺失18個堿基,產(chǎn)生的毒素A和毒素B分別是傳統(tǒng)毒株的16倍和23倍,導(dǎo)致艱難梭菌感染病死率和耐藥率均呈上升趨勢。鑒于其暴發(fā)頻率、危害性、國民的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),迫切需要對艱難梭菌二元毒素進(jìn)行有效的診斷和控制。目前,國際流行診斷艱難梭菌二元毒素的方法包括脈沖電場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE)、限制性核酸內(nèi)切酶分析(Restriction EndonucleaseAnalysis, REA)、核酸檢測(普通PCR和多重實時PCR),尚無統(tǒng)一的診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”。脈沖電場凝膠電泳(PFGE)不足之處：分型時間長、電泳條件復(fù)雜、需特殊的儀器和價格較高的試劑。限制性核酸內(nèi)切酶分析(REA)不足之處為DNA圖譜條帶太多,難以分辨,容易污染。而國內(nèi)最常用普通PCR和多重實時PCR檢測艱難梭菌中的二元毒素,但因?qū)嶒瀮x器要求高、操作繁瑣、耗時,擴(kuò)增完成后,仍需要通過對產(chǎn)物進(jìn)行電泳、顯影等步驟判讀結(jié)果,不適合各地基層醫(yī)院及現(xiàn)場快速檢測使用。因此,快速、特異、敏感檢測艱難梭菌中的二元毒素有助于及早篩選強(qiáng)毒力菌株,控制感染并指導(dǎo)臨床診療。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),即針對靶基因6-8個特定區(qū)域設(shè)計4-6條特異引物,恒溫(63-67℃)時,鏈置換DNA合成在BstDNA聚合酶的作用下,通過自我循環(huán)合成大量目的DNA并產(chǎn)生白色沉淀,從而實現(xiàn)對目的基因的快速檢測。該方法檢測時間短(30-60min),無需特殊儀器,操作簡便,配合相應(yīng)顯色試劑還能實現(xiàn)肉眼判別結(jié)果。目前,LAMP方法已成功應(yīng)用于細(xì)菌、病毒及寄生蟲的定性和定量檢測、胎兒性別鑒定等,已成為臨床常用的快速檢驗方法。研究目的和意義本研究旨在建立一種在恒溫條件下,快速、靈敏、特異、可視化、同步檢測艱難梭菌A、B毒素基因或同步檢測艱難梭菌二元毒素基因的方法,適用于基層醫(yī)療衛(wèi)生單位及各疾病預(yù)防控制中心篩查和檢測艱難梭菌及其高毒力菌株,為艱難梭菌的檢測及毒素分型提供新的技術(shù)平臺,有利于控制艱難梭菌感染的流行,指導(dǎo)臨床診療。研究方法及內(nèi)容研究對象：2013年8月1日-2014年1月31日期間,收集156例在南方醫(yī)院住院及門診腹瀉患者的新鮮糞便標(biāo)本(布里斯托分類5-7級),并檢測標(biāo)本艱難梭菌A、B毒素基因及二元毒素基因的攜帶情況。排除33例糞便標(biāo)本(23例重復(fù)標(biāo)本、10例糞便量太少或不滿足新鮮糞便標(biāo)本要求),剩余123例為適合本研究的糞便標(biāo)本。研究方法及內(nèi)容：1).環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法快速檢測艱難梭菌AB毒素基因。①引物的設(shè)計：通過BLAST軟件分別針對艱難梭菌tcdA與tcdB重復(fù)序列進(jìn)行同源性分析,獲得其特異性保守序列,并將目標(biāo)DNA分為6-8個獨(dú)立區(qū)域,用軟件Primer design V4針對該6-8個獨(dú)立區(qū)域設(shè)計分別得到用于對艱難梭菌tcdA與tcdB進(jìn)行LAMP檢測的引物。②最佳引物篩查：通過對各組引物擴(kuò)增效率的對比得出最佳引物組合。③最佳反應(yīng)溫度篩查：以艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463的DNA提取液作為模板,分別設(shè)置58℃-69℃ 12個溫度梯度對最佳引物進(jìn)行擴(kuò)增,比較其擴(kuò)增效率找出最佳反應(yīng)溫度。④敏感性實驗：以艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463的DNA提取液作為模板,用去離子水進(jìn)行10倍系列稀釋,濃度從207 ng/μl到0.000207 pg/μl,分別用LAMP, PCR方法檢測,比較兩者敏感性。LAMP法同時使用實時濁度儀和鈣黃綠色法判讀結(jié)果。⑤特異性實驗：用艱難梭菌標(biāo)準(zhǔn)株VPI10463作為陽性對照,去離子水作為陰性對照,分別用艱難梭菌tcdA與tcdB的最佳引物擴(kuò)增26株常見致病菌,分別用LAMP, PCR方法檢測。LAMP法同時使用實時濁度儀和鈣黃綠色法判讀結(jié)果。⑥糞便標(biāo)本檢測：對比LAMP法、PCR法和基因測序法檢測123份糞便標(biāo)本tcdA攜帶情況,以及對比LAMP法、PCR法和細(xì)胞毒素中和試驗檢測糞便標(biāo)本中艱難梭菌B毒素的攜帶情況。2).環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法快速檢測艱難梭菌二元毒素基因。①引物的設(shè)計：通過BLAST軟件分別針對艱難梭菌二元毒素基因cdtA與cdtB重復(fù)序列進(jìn)行同源性分析,獲得其特異性保守序列,并將目標(biāo)DNA分為6-8個獨(dú)立區(qū)域,用軟件Primer designV4針對該6-8個獨(dú)立區(qū)域設(shè)計分別得到用于對艱難梭菌cdtA與cdtB進(jìn)行LAMP檢測的引物。②最佳引物篩查：通過對各組引物擴(kuò)增效率的對比得出最佳引物組合。③最佳反應(yīng)溫度篩查：以艱難梭菌027型臨床分離株的DNA提取液作為模板,分別設(shè)置57℃-64℃ 8個溫度梯度對艱難梭菌cdtA最佳引物進(jìn)行擴(kuò)增、設(shè)置57℃-68℃12個溫度梯度對艱難梭菌cdtB最佳引物進(jìn)行擴(kuò)增,比較其擴(kuò)增效率找出最佳反應(yīng)溫度。④敏感性實驗：以艱難梭菌027型臨床分離株的DNA提取液作為模板,用去離子水進(jìn)行10倍系列稀釋,濃度從24.8ng/μl到0.000248pg/μl,分別用LAMP,PCR方法檢測,比較兩者敏感性。LAMP法同時使用實時濁度儀和鈣黃綠色法判讀結(jié)果。⑤特異性實驗：用艱難梭菌027型臨床分離株作為陽性對照,去離子水作為陰性對照,分別用艱難梭菌二元毒素基因cdtA與cdtB的最佳引物擴(kuò)增25株常見致病菌,分別用LAMP,PCR方法檢測。LAMP法同時使用實時濁度儀和鈣黃綠色法判讀結(jié)果。⑥糞便標(biāo)本檢測：對比評價LAMP法和PCR法檢測123份糞便標(biāo)本艱難梭菌cdtA與cdtB的攜帶情況。研究過程結(jié)果1).LAMP去檢測艱難梭菌毒素特異基因tcdA的最佳引物是A12,最佳反應(yīng)條件是：61℃,反應(yīng)60min。LAMP法檢測艱難梭菌毒素特異基因tcdB的最佳引物是B0,最佳反應(yīng)條件是：60℃,反應(yīng)60min。同步檢測tcdA及tcdB的最佳反應(yīng)條件是：60℃,反應(yīng)60min。LAMP法只擴(kuò)增攜帶tcdA或tcdB基因的艱難梭菌,特異性良好。LAMP法對艱難梭菌毒素特異基因tcdA及tcdB的最低檢出限均為20.7pg/μl,靈敏度為PCR法的10倍(PCR為207pg/μl)�；驕y序法檢測123例糞便標(biāo)本,艱難梭菌tcdA的陽性率為29.3%(36/123),雖然LAMP法與PCR法的特異度無統(tǒng)計學(xué)差異,但是LAMP法的靈敏度、與基因測序的一致百分率均較PCR法高�！敖饦�(biāo)準(zhǔn)”-細(xì)胞毒素中和試驗檢測123例糞便標(biāo)本,艱難梭菌B毒素的陽性率為25.2%,而LAMP法與PCR法檢測糞便標(biāo)本艱難梭菌B毒素的靈敏度、特異度均無統(tǒng)計學(xué)差異。2).LAMP法檢測艱難梭菌二元毒素cdtA基因的最佳引物是A2,最佳反應(yīng)條件是：60℃恒溫90min；檢測cdtB的最佳引物是B4,最佳反應(yīng)條件是：63℃恒溫90min；同步檢測cdtA和cdtB的最佳反應(yīng)條件為：61℃恒溫90min。LAMP法只擴(kuò)增攜帶cdtA和cdtB基因的艱難梭菌,特異性良好。LAMP法對艱難梭菌毒素特異基因cdtA和cdtB的最低檢出限均為24.8pg/μl,靈敏度為PCR法的10倍(PCR為248pg/μl)。LAMP法與PCR法檢測糞便標(biāo)本cdtA和cdtB時,兩者檢測結(jié)果完全一致。結(jié)論本研究已成功建立一種快速、特異、敏感、可視化、同步檢測艱難梭菌A、B毒素基因或同步檢測艱難梭菌二元毒素基因的方法,有望成為臨床快速篩選艱難梭菌及其高毒力菌株的檢測手段之一。
【關(guān)鍵詞】：環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法 艱難梭菌 毒素A基因 毒素B基因 二元毒素基因 檢測
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R516;R440
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-19
• 第一章 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法快速檢測艱難梭菌AB毒素基因19-44
• 1.1 引言19-20
• 1.2 材料和方法20-30
• 1.3 結(jié)果30-41
• 1.4 討論41-44
• 第二章 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法快速檢測艱難梭菌二元毒素基因44-61
• 2.1 引言44-47
• 2.2 材料和方法47-50
• 2.3 結(jié)果50-59
• 2.4 討論59-61
• 全文小結(jié)與展望61-62
• 參考文獻(xiàn)62-65
• 中英文縮略對照圖65-66
• 碩士期間成果66-68
• 綜述68-77
• 參考文獻(xiàn)73-77
• 致謝77-79

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Bryan F Curtin;Yousef Zarbalian;Mark H Flasar;Erik von Rosenvinge;;Clostridium difficile-associated disease:Adherence with current guidelines at a tertiary medical center[J];World Journal of Gastroenterology;2013年46期

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本文編號：580088