本文關(guān)鍵詞：人源化小鼠模型的構(gòu)建及人巨細(xì)胞病的的監(jiān)測(cè)

  更多相關(guān)文章： 造血干細(xì)胞移植 人源化小鼠模型 NPG小鼠 人巨細(xì)胞病毒

【摘要】：造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是治療血液系統(tǒng)疾病如白血病、骨髓增生異常綜合癥、再生障礙性貧血、淋巴瘤等有效方法之一。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展,HSCT在臨床中應(yīng)用越來(lái)越廣泛,雖然移植技術(shù)及方法都有了很大進(jìn)步,但HSCT后人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染依然是影響患者長(zhǎng)期生存的重要因素之一。HCMV感染在中國(guó)人群中非常普遍,大約95%的中國(guó)人感染過(guò)HCMV。HCMV的感染率隨著年齡的增加而增多[1],它可以通過(guò)唾液、尿液、性接觸及血液制品傳播[2]。HCMV感染分為原發(fā)感染、再發(fā)感染和潛伏感染:(1)原發(fā)感染:初次感染,即在HCMV血清學(xué)陰性患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)HCMV或其產(chǎn)物;(2)再發(fā)感染:HCMV血清學(xué)陽(yáng)性患者體內(nèi)潛伏的病毒再次激活或再次感染不同的外源性HCMV病毒株;(3)潛伏感染:HCMV基因組DNA持續(xù)存在于宿主細(xì)胞內(nèi),任何檢測(cè)方法都無(wú)法檢測(cè)到病毒產(chǎn)物,但在免疫力低下的時(shí)候HCMV被激活,產(chǎn)生新的病毒顆粒。HCMV病指通過(guò)活檢獲得的標(biāo)本或其他有創(chuàng)操作獲得的標(biāo)本采用敏感性和特異性檢查方法檢測(cè)到HCMV,同時(shí)伴有相應(yīng)器官感染的癥狀和(或)體征。HCMV病包括:間質(zhì)性肺炎,視網(wǎng)膜炎,腸炎和其他少見(jiàn)的如出血性膀胱炎和肝炎等[3]。對(duì)于免疫系統(tǒng)功能正常的人來(lái)講,HCMV感染后常無(wú)任何臨床癥狀,但一旦感染后HCMV即可在體內(nèi)終身潛伏,潛伏在血液系統(tǒng)的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)及造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cell,HSC)中[4]。在免疫力低下者(如嬰幼兒、艾滋病、HSCT、實(shí)體器官移植等)無(wú)論是HCMV原發(fā)感染或再激活,都會(huì)產(chǎn)生明顯的癥狀甚至嚴(yán)重的HCMV病。HSCT后HCMV的感染很常見(jiàn)[5,6],尤其是發(fā)生急性移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的患者,其發(fā)生HCMV感染的風(fēng)險(xiǎn)更高[7,8]。HCMV血清學(xué)陽(yáng)性的受者移植后100 d內(nèi)約45%~85%出現(xiàn)HCMV原發(fā)感染或再激活感染,在不用抗病毒藥物治療的情況下,這些患者中約有25%~30%將要進(jìn)展為HCMV終末器官疾病[9]。HCMV肺炎是致命性疾病,病死率高達(dá)90%[3],并且發(fā)病率也較高,自體HSCT(auto-HSCT)其發(fā)病率為1%~6%,異基因HSCT(allo-HSCT)發(fā)病率約為10%~30%[5]。HCMV肺炎發(fā)生的危險(xiǎn)因素包括淋巴細(xì)胞減少癥、男性及嚴(yán)重的GVHD。HCMV感染對(duì)人們的危害已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。目前全球每年共約有13萬(wàn)以上的實(shí)體器官移植及HSCT,而HCMV感染是導(dǎo)致患者移植后死亡的重要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì),8%~32%的腎移植患者、39%~41%的肺或心臟移植的患者、22%~29%的肝移植患者、50%胰腺移植患者均受累于HCMV感染[10,11]。HCMV感染也是導(dǎo)致新生兒缺陷最主要的感染性因素[12],且發(fā)現(xiàn)HCMV感染與多種癌癥的發(fā)生有關(guān),如宮頸癌、結(jié)直腸癌等,HCMV感染還是心血管疾病發(fā)生的共同致病因素[13]。目前hcmv感染機(jī)制仍然不完全明確,hcmv的治療方式主要是化學(xué)藥物及細(xì)胞免疫治療,但各自都有其局限性。cmv具有高度的種屬特異性,即hcmv不能直接感染小鼠,鼠巨細(xì)胞病毒(mousecytomegalovirus,mcmv)也不能直接感染人。因hcmv會(huì)潛伏到造血干/祖細(xì)胞中,所以本試驗(yàn)主要是探索性研究利用粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor,g-csf)動(dòng)員的hcmv血清學(xué)陽(yáng)性供者外周血cd34+hsc建立hu-hsc-npgtm(nod.cg-prkdcscidii2rgtm1vst/vst)模型,同時(shí)在小鼠的血液、組織器官檢測(cè)是否發(fā)生hcmv的感染,以期為研究hcmv感染機(jī)制、治療提供動(dòng)物模型平臺(tái)。本研究主要分為兩個(gè)部分:首先,實(shí)驗(yàn)組小鼠移植前眼眶取血,npg小鼠照射后4~24小時(shí)內(nèi),骨髓腔注射磁珠分選的cd34+干細(xì)胞,觀察小鼠的生存狀態(tài);移植后的第10d處死一只照射后的小鼠及未照射的小鼠,取出小鼠的股骨,福爾馬林液固定,制作病理切片,觀察清髓效果;移植后第2周和第4周眼眶采血檢測(cè)小鼠血象恢復(fù)情況;移植后第4、6、8、10、12周用流式細(xì)胞儀動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)小鼠外周血中人cd45+細(xì)胞比例。其次,移植后用pcr方法檢測(cè)小鼠外周血中是否檢測(cè)到hcmv的dna拷貝數(shù);12周后處死各組小鼠,取出小鼠的肝臟、脾臟及骨髓細(xì)胞,檢測(cè)骨髓、肝臟、脾臟細(xì)胞cd45+、cd19+細(xì)胞表達(dá)及是否存在hcmv的感染;取出小鼠的肺及腸道組織經(jīng)福爾馬林固定,制作組織切片,免疫組化檢測(cè)腸道及肺臟是否感染hcmv;提取小鼠骨髓細(xì)胞dna,運(yùn)用pcr方法檢測(cè)骨髓細(xì)胞人alu基因的表達(dá)情況。通過(guò)試驗(yàn)可以得出以下結(jié)果:(1)磁珠分選的cd34+干細(xì)胞純度可高達(dá)96.3%;(2)npg小鼠照射后骨髓腔內(nèi)有核細(xì)胞及巨核細(xì)胞數(shù)量均明顯減少甚至消失,達(dá)到了清髓的效果;(3)實(shí)驗(yàn)組小鼠第4周外周血白細(xì)胞、血紅蛋白及血小板恢復(fù)到移植前水平;(4)實(shí)驗(yàn)組小鼠在第4、6、8、10、12周均檢測(cè)到了人cd45+細(xì)胞;(5)利用pcr方法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組小鼠人alu基因全部陽(yáng)性;(6)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血、組織細(xì)胞及免疫組化病理切片中均未檢測(cè)到hcmv。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:骨髓腔注射移植hcmv血清學(xué)陽(yáng)性供者外周血cd34+干細(xì)胞至npg小鼠均可以在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到人cd45+細(xì)胞,說(shuō)明可以建立人鼠嵌合模型;在npg小鼠組織細(xì)胞、血液中均未檢測(cè)到hcmv,說(shuō)明hcmv血清學(xué)陽(yáng)性cd34+造血干細(xì)胞能否使npg小鼠感染hcmv,有待進(jìn)一步驗(yàn)證。過(guò)去人源化小鼠模型大多是以尾靜脈注射臍血單個(gè)核細(xì)胞移植到nod/scid(非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷)小鼠。hcmv感染小鼠模型是將人的hcmv在體外與人胚肺成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)后通過(guò)腹腔注射到小鼠體內(nèi),觀察其感染情況,雖然此辦法可行,但不能研究hcmv潛伏感染-再激活機(jī)制及不能為細(xì)胞免疫治療提供動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)在于選擇目前國(guó)際上最適合做移植、免疫缺陷程度最高的npg小鼠,模擬臨床hcmv血清學(xué)陽(yáng)性供者干細(xì)胞回輸給陰性患者的情況,探索性的研究利用HCMV血清學(xué)陽(yáng)性供者的CD34~+HSC骨髓腔注射給NPG小鼠,觀察其在人源化的同時(shí)是否可以感染HCMV。
【關(guān)鍵詞】：造血干細(xì)胞移植 人源化小鼠模型 NPG小鼠 人巨細(xì)胞病毒
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R-332;R511
【目錄】：

• 縮略詞表4-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-16
• 第一部分：人源化小鼠模型的建立16-28
• 實(shí)驗(yàn)流程16-17
• 實(shí)驗(yàn)材料17-19
• 實(shí)驗(yàn)方法19-22
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-26
• 討論26-28
• 第二部分：小鼠組織細(xì)胞中人源細(xì)胞及HCMV的檢測(cè)28-42
• 實(shí)驗(yàn)流程28-29
• 實(shí)驗(yàn)材料29-31
• 實(shí)驗(yàn)方法31-35
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-39
• 討論39-42
• 結(jié)論42-43
• 參考文獻(xiàn)43-48
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷48-49
• 致謝49

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中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：569565