人源化小鼠模型的構(gòu)建及人巨細胞病的的監(jiān)測

發(fā)布時間：2017-07-20 19:15

本文關(guān)鍵詞：人源化小鼠模型的構(gòu)建及人巨細胞病的的監(jiān)測

【摘要】：造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是治療血液系統(tǒng)疾病如白血病、骨髓增生異常綜合癥、再生障礙性貧血、淋巴瘤等有效方法之一。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,HSCT在臨床中應(yīng)用越來越廣泛,雖然移植技術(shù)及方法都有了很大進步,但HSCT后人巨細胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染依然是影響患者長期生存的重要因素之一。HCMV感染在中國人群中非常普遍,大約95%的中國人感染過HCMV。HCMV的感染率隨著年齡的增加而增多[1],它可以通過唾液、尿液、性接觸及血液制品傳播[2]。HCMV感染分為原發(fā)感染、再發(fā)感染和潛伏感染:(1)原發(fā)感染:初次感染,即在HCMV血清學(xué)陰性患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)HCMV或其產(chǎn)物;(2)再發(fā)感染:HCMV血清學(xué)陽性患者體內(nèi)潛伏的病毒再次激活或再次感染不同的外源性HCMV病毒株;(3)潛伏感染:HCMV基因組DNA持續(xù)存在于宿主細胞內(nèi),任何檢測方法都無法檢測到病毒產(chǎn)物,但在免疫力低下的時候HCMV被激活,產(chǎn)生新的病毒顆粒。HCMV病指通過活檢獲得的標本或其他有創(chuàng)操作獲得的標本采用敏感性和特異性檢查方法檢測到HCMV,同時伴有相應(yīng)器官感染的癥狀和(或)體征。HCMV病包括:間質(zhì)性肺炎,視網(wǎng)膜炎,腸炎和其他少見的如出血性膀胱炎和肝炎等[3]。對于免疫系統(tǒng)功能正常的人來講,HCMV感染后常無任何臨床癥狀,但一旦感染后HCMV即可在體內(nèi)終身潛伏,潛伏在血液系統(tǒng)的單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞(dendritic cell,DC)及造血干細胞(hematopoietic stem cell,HSC)中[4]。在免疫力低下者(如嬰幼兒、艾滋病、HSCT、實體器官移植等)無論是HCMV原發(fā)感染或再激活,都會產(chǎn)生明顯的癥狀甚至嚴重的HCMV病。HSCT后HCMV的感染很常見[5,6],尤其是發(fā)生急性移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的患者,其發(fā)生HCMV感染的風(fēng)險更高[7,8]。HCMV血清學(xué)陽性的受者移植后100 d內(nèi)約45%~85%出現(xiàn)HCMV原發(fā)感染或再激活感染,在不用抗病毒藥物治療的情況下,這些患者中約有25%~30%將要進展為HCMV終末器官疾病[9]。HCMV肺炎是致命性疾病,病死率高達90%[3],并且發(fā)病率也較高,自體HSCT(auto-HSCT)其發(fā)病率為1%~6%,異基因HSCT(allo-HSCT)發(fā)病率約為10%~30%[5]。HCMV肺炎發(fā)生的危險因素包括淋巴細胞減少癥、男性及嚴重的GVHD。HCMV感染對人們的危害已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注。目前全球每年共約有13萬以上的實體器官移植及HSCT,而HCMV感染是導(dǎo)致患者移植后死亡的重要原因之一。據(jù)統(tǒng)計,8%~32%的腎移植患者、39%~41%的肺或心臟移植的患者、22%~29%的肝移植患者、50%胰腺移植患者均受累于HCMV感染[10,11]。HCMV感染也是導(dǎo)致新生兒缺陷最主要的感染性因素[12],且發(fā)現(xiàn)HCMV感染與多種癌癥的發(fā)生有關(guān),如宮頸癌、結(jié)直腸癌等,HCMV感染還是心血管疾病發(fā)生的共同致病因素[13]。目前hcmv感染機制仍然不完全明確,hcmv的治療方式主要是化學(xué)藥物及細胞免疫治療,但各自都有其局限性。cmv具有高度的種屬特異性,即hcmv不能直接感染小鼠,鼠巨細胞病毒(mousecytomegalovirus,mcmv)也不能直接感染人。因hcmv會潛伏到造血干/祖細胞中,所以本試驗主要是探索性研究利用粒細胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor,g-csf)動員的hcmv血清學(xué)陽性供者外周血cd34+hsc建立hu-hsc-npgtm(nod.cg-prkdcscidii2rgtm1vst/vst)模型,同時在小鼠的血液、組織器官檢測是否發(fā)生hcmv的感染,以期為研究hcmv感染機制、治療提供動物模型平臺。本研究主要分為兩個部分:首先,實驗組小鼠移植前眼眶取血,npg小鼠照射后4~24小時內(nèi),骨髓腔注射磁珠分選的cd34+干細胞,觀察小鼠的生存狀態(tài);移植后的第10d處死一只照射后的小鼠及未照射的小鼠,取出小鼠的股骨,福爾馬林液固定,制作病理切片,觀察清髓效果;移植后第2周和第4周眼眶采血檢測小鼠血象恢復(fù)情況;移植后第4、6、8、10、12周用流式細胞儀動態(tài)監(jiān)測小鼠外周血中人cd45+細胞比例。其次,移植后用pcr方法檢測小鼠外周血中是否檢測到hcmv的dna拷貝數(shù);12周后處死各組小鼠,取出小鼠的肝臟、脾臟及骨髓細胞,檢測骨髓、肝臟、脾臟細胞cd45+、cd19+細胞表達及是否存在hcmv的感染;取出小鼠的肺及腸道組織經(jīng)福爾馬林固定,制作組織切片,免疫組化檢測腸道及肺臟是否感染hcmv;提取小鼠骨髓細胞dna,運用pcr方法檢測骨髓細胞人alu基因的表達情況。通過試驗可以得出以下結(jié)果:(1)磁珠分選的cd34+干細胞純度可高達96.3%;(2)npg小鼠照射后骨髓腔內(nèi)有核細胞及巨核細胞數(shù)量均明顯減少甚至消失,達到了清髓的效果;(3)實驗組小鼠第4周外周血白細胞、血紅蛋白及血小板恢復(fù)到移植前水平;(4)實驗組小鼠在第4、6、8、10、12周均檢測到了人cd45+細胞;(5)利用pcr方法檢測實驗組小鼠人alu基因全部陽性;(6)整個實驗過程中實驗組小鼠外周血、組織細胞及免疫組化病理切片中均未檢測到hcmv。實驗結(jié)論:骨髓腔注射移植hcmv血清學(xué)陽性供者外周血cd34+干細胞至npg小鼠均可以在小鼠體內(nèi)檢測到人cd45+細胞,說明可以建立人鼠嵌合模型;在npg小鼠組織細胞、血液中均未檢測到hcmv,說明hcmv血清學(xué)陽性cd34+造血干細胞能否使npg小鼠感染hcmv,有待進一步驗證。過去人源化小鼠模型大多是以尾靜脈注射臍血單個核細胞移植到nod/scid(非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷)小鼠。hcmv感染小鼠模型是將人的hcmv在體外與人胚肺成纖維細胞共培養(yǎng)后通過腹腔注射到小鼠體內(nèi),觀察其感染情況,雖然此辦法可行,但不能研究hcmv潛伏感染-再激活機制及不能為細胞免疫治療提供動物模型。本實驗的創(chuàng)新點在于選擇目前國際上最適合做移植、免疫缺陷程度最高的npg小鼠,模擬臨床hcmv血清學(xué)陽性供者干細胞回輸給陰性患者的情況,探索性的研究利用HCMV血清學(xué)陽性供者的CD34~+HSC骨髓腔注射給NPG小鼠,觀察其在人源化的同時是否可以感染HCMV。
【關(guān)鍵詞】：造血干細胞移植 人源化小鼠模型 NPG小鼠 人巨細胞病毒
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R-332;R511
【目錄】：