本文關(guān)鍵詞：結(jié)核桿菌兩個毒力因子CFP-10和ESAT-6協(xié)同對宿主細胞的影響及其機制研究

  更多相關(guān)文章： 結(jié)核分枝桿菌 細胞模型 CFP-10/ESAT-6復合物

【摘要】：結(jié)核分枝桿菌在宿主細胞內(nèi)長期寄生可以引起結(jié)核病。小分子分泌蛋白CFP-10和ESAT-6是結(jié)核分枝桿菌的毒力因子,在結(jié)核分枝桿菌感染和致病的過程中發(fā)揮了重要作用。在結(jié)核分枝桿菌感染宿主寄生于胞內(nèi)的過程中,結(jié)核分枝桿菌的兩個毒力因子CFP-10和ESAT-6在宿主細胞中發(fā)揮作用的機制仍不清楚。本課題組前期構(gòu)建了CFP-10-PEGFP-N1和ESAT-6-PEGFP-N1真核表達載體,分別轉(zhuǎn)染真核細胞,初步觀察了兩個毒力因子單獨作用對宿主細胞凋亡的影響。目的:在前期研究的基礎上,本實驗采用基因工程技術(shù)構(gòu)建了荷有紅色熒光報告基因的CFP-10-PDsRed1-N1,與荷有綠色熒光報告基因的ESAT-6-PEGFP-N1共同轉(zhuǎn)染真核細胞,獲得CFP-10基因和ESAT-6基因在同一細胞內(nèi)表達的細胞模型,進而初步探討結(jié)核分枝桿菌毒力因子CFP-10、ESAT-6協(xié)同對細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響。方法:雙酶切CFP-10-PEGFP-N1真核重組表達質(zhì)粒,獲得CFP-10基因片段,將CFP-10基因插入PDs Red1-N1真核表達載體,構(gòu)建含有紅色熒光報告基因的CFP-10-PDsRed1-N1真核重組表達載體。按照以下分組形式:1.PEGFP-N1組2.PDs Red1-N1組3.PEGFP-N1和PDs Red1-N1雙轉(zhuǎn)染組4.CFP-10-PDsRed1-N1組5.ESAT-6-PEGFP-N1組6.CFP-10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1雙轉(zhuǎn)染組7.脂質(zhì)體組8.空白對照組采用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染293FT細胞,通過倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后細胞出現(xiàn)的熒光情況,用Western Blot方法檢測轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)CFP-10蛋白和ESAT-6蛋白的表達狀況,利用激光共聚焦顯微技術(shù)觀察分析轉(zhuǎn)染后的細胞中CFP-10蛋白和ESAT-6蛋白共定位的情況。用實時定量PCR技術(shù)檢測四個凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、Caspase-8、Caspase-3在轉(zhuǎn)染前后細胞內(nèi)的動態(tài)表達情況。結(jié)果:構(gòu)建獲得了序列正確的CFP10-PDsRed1-N1真核重組表達載體;獲得了結(jié)核分枝桿菌兩個毒力因子CFP-10基因和ESAT-6基因共同表達的真核細胞模型,通過倒置熒光顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的293FT細胞能夠分別發(fā)出紅色熒光和綠色熒光;Western Blot檢測結(jié)果證實融合蛋白PDSRED-CFP-10和PEGFP-ESAT-6在轉(zhuǎn)染的細胞中獲得表達,通過激光共聚焦顯微技術(shù)觀察,又發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒PEGFP-N1和PDs Red1-N1組293FT細胞的紅色熒光和綠色熒光主要分布在細胞質(zhì)中,經(jīng)merge后在細胞的一部分區(qū)域的紅色熒光和綠色熒光疊加為黃色,另外一部分區(qū)域仍保持紅色熒光,提示紅色熒光與綠色熒光分布不完全一致;轉(zhuǎn)染CFP10-PDs Red1-N1和ESAT6-PEGFP-N1組293FT細胞黃色熒光也分布于細胞質(zhì),經(jīng)merge后在胞質(zhì)中均為黃色,提示紅色熒光與綠色熒光分布一致。采用熒光實時定量PCR檢測四個凋亡相關(guān)基因在轉(zhuǎn)染前后細胞內(nèi)的動態(tài)表達的結(jié)果顯示,CFP-10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1雙轉(zhuǎn)染組的細胞中,轉(zhuǎn)染后24 h的Bcl-2基因的表達量比轉(zhuǎn)染后12 h增加幅度大,轉(zhuǎn)染后24 h的Bax基因的表達量比轉(zhuǎn)染后12 h增加幅度小,且Bax/Bcl-2比率變化呈下降趨勢,并在24 h降低幅度大。在CFP-10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1雙轉(zhuǎn)染組的細胞中,轉(zhuǎn)染后24 h的Caspase-8基因表達量比轉(zhuǎn)染后12 h降低幅度大,與此同時,轉(zhuǎn)染后24 h的Caspase-3基因的相對表達量比轉(zhuǎn)染后12h降低幅度大,且隨時間的增加,總體呈現(xiàn)降低的趨勢。結(jié)論:獲得CFP-10-PDs Red1-N1真核重組表達載體能夠在真核細胞中正確表達,成功構(gòu)建了兩個毒力因子CFP-10基因和ESAT-6基因在同一細胞內(nèi)表達的細胞模型,CFP-10基因和ESAT-6基因在同一個細胞內(nèi)表達互不干擾,其蛋白產(chǎn)物在細胞中的分布是一致的,提示這兩個毒力因子在細胞內(nèi)可能是以復合物的形式存在和發(fā)揮作用。采用熒光實時定量PCR對各組細胞進行凋亡相關(guān)基因檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)CFP-10/ESAT-6復合物可能影響細胞內(nèi)的Bax/Bcl-2比率,使之下降。CFP-10-PDsRed1-N1和ESAT-6-PEGFP-N1雙轉(zhuǎn)染組和PEGFP-N1和PDs Red1-N1雙轉(zhuǎn)染組Caspase-8和Caspase-3基因的相對表達量均降低。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 細胞模型 CFP-10/ESAT-6復合物
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R52
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文縮寫詞表12-14
• 前言14-15
• 第一部分 結(jié)核分枝桿菌毒力因子CFP-10真核重組表達載體的構(gòu)建15-22
• 1 材料與方法15-18
• 1.1 材料15-16
• 1.2 方法16-18
• 2 結(jié)果18-20
• 2.1 CFP-10基因的獲得18-19
• 2.2 CFP10PDs Red1-N1真核重組表達載體的構(gòu)建與鑒定19-20
• 3 討論20-22
• 第二部分 結(jié)核分枝桿菌CFP-10和ESAT-6 真核表達載體雙轉(zhuǎn)染真核細胞的觀察22-35
• 1 材料與方法23-27
• 1.1 材料23
• 1.2 方法23-27
• 2 結(jié)果27-33
• 2.1 待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的準備結(jié)果27
• 2.2 轉(zhuǎn)染后真核細胞 293FT觀察結(jié)果27-30
• 2.3 CFP-10基因在真核細胞 293FT中表達的Western Blot檢測30-31
• 2.4 ESAT-6 基因在真核細胞 293FT中表達的Western Blot檢測31
• 2.5 激光共聚焦觀察31-33
• 3 討論33-35
• 第三部分 結(jié)核分枝桿菌毒力因子CFP-10、ESAT-6 協(xié)同對細胞凋亡相關(guān)基因表達影響的檢測35-57
• 1 材料與方法35-38
• 1.1 材料36
• 1.2 方法36-38
• 2 結(jié)果38-54
• 2.1 總RNA的提取結(jié)果38
• 2.2 實時定量PCR法檢測基因表達量的結(jié)果38-54
• 3 討論54-57
• 總結(jié)57-58
• 文獻綜述58-65
• 1 結(jié)核病的流行病學58-59
• 2 結(jié)核分枝桿菌感染的初始階段59-60
• 3 結(jié)核分枝桿菌的生物學特征60
• 4 結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)及CFP-10和ESAT-6 的相關(guān)研究60-65
• 4.1 結(jié)核分枝桿菌RD1區(qū)60-61
• 4.2 結(jié)核分枝桿菌CFP-10和ESAT-6 的相關(guān)研究61-65
• 參考文獻65-73
• 致謝73-74
• 作者簡介74-75
• 導師評閱表75

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 韓陽;官大威;侯震寰;趙銳;路斌;;caspase-8及其研究進展[J];中國法醫(yī)學雜志;2006年02期

2 杜明梅;葉玲;劉建偉;劉靜;楊立娜;;Kozak序列+4G提高綠色熒光蛋白在HEK293細胞中的表達[J];生物工程學報;2008年03期

3 李超;伏圣博;劉華玲;馬欣榮;;細胞凋亡研究進展[J];世界科技研究與發(fā)展;2007年03期

4 王黎霞;成詩明;陳明亭;趙雁林;張慧;姜世聞;何廣學;呂青;杜昕;陳偉;劉小秋;阮云洲;王勝芬;夏aa;于蘭;李峻;李雪;;2010年全國第五次結(jié)核病流行病學抽樣調(diào)查報告[J];中國防癆雜志;2012年08期

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 關(guān)迪;陽離子脂質(zhì)體的細胞毒性作用研究[D];大連工業(yè)大學;2014年

，

本文編號：557149