本文關(guān)鍵詞：日本血吸蟲蟲卵及相關(guān)抗原的研究

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【摘要】：血吸蟲病是人畜共患寄生蟲病。血吸蟲感染的實(shí)驗(yàn)診斷在血吸蟲病防治中發(fā)揮重要作用,目前血吸蟲蟲卵依然是主要的血吸蟲病診斷抗原,對(duì)血吸蟲蟲卵的提取、蟲卵可溶性抗原(SEA)的認(rèn)識(shí)依然不足。本課題目的是建立一種快速提取純凈蟲卵的方法;檢測(cè)用該法提取蟲卵制備SEA作為血吸蟲病檢測(cè)抗原的可行性;然后采用免疫親和層析的方法收集與血吸蟲病IgG發(fā)生特異性結(jié)合的SEA組分并進(jìn)行鑒定和分析;最后從鑒定的抗原組分中選取一種抗原進(jìn)行基因的克隆表達(dá),檢測(cè)其作為診斷抗原的價(jià)值。用不同濃度的NaOH、在不同溫度、用不同時(shí)間消化含有蟲卵的肝臟勻漿液,以確定蟲卵提取最佳條件;用方陣實(shí)驗(yàn)確定以此法提取的SEA最佳抗原包被濃度并采用ELISA法檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)獲得的75份血吸蟲陽(yáng)性、60份血吸蟲陰性水牛血清,以評(píng)價(jià)抗原的檢測(cè)效果;最終用該SEA組分試制了日本血吸蟲血清檢測(cè)的間接血凝試劑。結(jié)果表明NaOH消蝕法提取組織中蟲卵的最佳條件為:NaOH濃度為5%~10%,反應(yīng)溫度為45℃,反應(yīng)時(shí)間為5-10min;該法制備的蟲卵純凈度高,得率為常規(guī)法的3倍以上;NaOH消蝕法提取抗原的檢測(cè)靈敏度比過(guò)篩提取蟲卵所得抗原顯著性提高(p0.05);用消蝕法提取蟲卵抗原檢測(cè)水牛血清其靈敏性為93%,過(guò)篩法為88%,特異性為100%,過(guò)篩法為97%(P0.05)。所試制的間接血凝試劑對(duì)于檢測(cè)兔、鼠血清具有較好的效果。為進(jìn)一步從SEA獲得具有診斷價(jià)值的主要抗原信息,從血吸蟲病陽(yáng)性鼠血清純化得到IgG,并將其固化到樹脂上;通過(guò)免疫親和層析的方法收集與IgG發(fā)生特異性結(jié)合的SEA抗原組分并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定、糖蛋白和生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示:陽(yáng)性BALB/c鼠血清中純化的IgG通過(guò)免疫親和層析收集SEA的組分保持了抗原性;質(zhì)譜共鑒定到76個(gè)蛋白群的262個(gè)蛋白質(zhì);主要參與血吸蟲的代謝過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)等;這些蛋白具有結(jié)合及催化活性、電子載體活性、酶調(diào)節(jié)活性等相關(guān)功能;Dot-blot/SDS-PAGE結(jié)合糖蛋白染色顯示,SEA層析組分具有糖鏈成分且為各種糖蛋白的組合,分子量分布范圍從37-170kd;N-端糖基化預(yù)測(cè)顯示抗原組分中有57個(gè)蛋白群中的蛋白具有N-端糖基化位點(diǎn);這些可能的糖蛋白主要參與信號(hào)傳導(dǎo)、免疫系統(tǒng)過(guò)程、應(yīng)激反應(yīng)、移動(dòng)等生物過(guò)程。根據(jù)蟲卵可溶性抗原鑒定信息,選取SjP40蛋白作為研究對(duì)象;利用PCR獲得了基因的全長(zhǎng)表達(dá)片段,構(gòu)建了該基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-SjP40并獲得了重組表達(dá)蛋白,rSj P40主要以可溶性蛋白的形式存在;Western blot顯示rSj P40有較好的免疫原性;收集感染血吸蟲不同階段的的BALB/c鼠血清檢測(cè)顯示rSjP40具有早期診斷效果。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲 蟲卵 抗原成分 SjP40
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R532.21
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-13
• 英文縮略表13-14
• 第一章 引言14-23
• 1.1 血吸蟲病概述14
• 1.2 血吸蟲病實(shí)驗(yàn)診斷方法研究概況14-18
• 1.2.1 檢測(cè)蟲卵方法14-15
• 1.2.2 檢測(cè)抗體方法15-17
• 1.2.3 檢測(cè)抗原方法17
• 1.2.4 檢測(cè)DNA方法17-18
• 1.3 血吸蟲病診斷用抗原研究概況18-22
• 1.3.1 蟲體抗原18-19
• 1.3.2 組分抗原19-20
• 1.3.3 重組抗原20-22
• 1.3.4 其他抗原22
• 1.4 目的和意義22-23
• 第二章 日本血吸蟲沉積蟲卵提取方法和間接血凝試驗(yàn)23-33
• 2.1 引言23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料23-25
• 2.2.1 生物材料23-24
• 2.2.2 儀器設(shè)備24
• 2.2.3 酶和試劑24
• 2.2.4 試劑配方24-25
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法25-27
• 2.3.1 兔人工感染血吸蟲尾蚴25
• 2.3.2 肝臟蟲卵計(jì)數(shù)25
• 2.3.3 兩種提取蟲卵方法比較25-26
• 2.3.4 制備蟲卵可溶性抗原26
• 2.3.5 蟲卵可溶性抗原包被濃度確定26
• 2.3.6 檢測(cè)SEA靈敏度26
• 2.3.7 檢測(cè)SEA敏感性和檢出率26
• 2.3.8 SAS軟件統(tǒng)計(jì)分析26
• 2.3.9 間接血凝診斷試劑建立26-27
• 2.4 結(jié)果27-31
• 2.4.1 不同參數(shù)下NaOH消蝕法提取蟲卵效果27-28
• 2.4.2 提取蟲卵兩種方法的比較28-29
• 2.4.3 消蝕法提取蟲卵制備SEA用于檢測(cè)血吸蟲病29-30
• 2.4.4 蟲卵抗原檢測(cè)的敏感性以及檢出率30
• 2.4.5 基于SEA的間接血凝實(shí)驗(yàn)30-31
• 2.4.6 IHA檢測(cè)鼠和兔陰陽(yáng)性血清結(jié)果31
• 2.5 討論31-33
• 第三章 沉積蟲卵主要抗原成分分析33-53
• 3.1 引言33
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料33-36
• 3.2.1 生物材料33-34
• 3.2.2 儀器設(shè)備34
• 3.2.3 主要試劑34
• 3.2.4 試劑配方34-36
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法36-42
• 3.3.1 技術(shù)路線36-37
• 3.3.2 蟲卵可溶性抗原提取37
• 3.3.3 日本血吸蟲陽(yáng)性血清IgG純化37-38
• 3.3.4 免疫親和層析柱的制備及SEA的親和層析38-39
• 3.3.5 SEA組分的SDS-PAGE銀染39-40
• 3.3.6 Dot-blot鑒定免疫親和層析后的SEA組分40
• 3.3.7 LC-MS鑒定SEA親和層析組分中的蛋白40-41
• 3.3.8 SEA親和層析組分蛋白的生物信息學(xué)分析41
• 3.3.9 SEA親和層析組分中糖蛋白分析41-42
• 3.4 結(jié)果42-51
• 3.4.1 日本血吸蟲陽(yáng)性血清IgG純化42
• 3.4.2 SDS-PAGE銀染鑒定SEA親和層析組分42-43
• 3.4.3 Dot-blot鑒定SEA親和層析組分抗原性43-44
• 3.4.4 LC-MS鑒定SEA親和層析組分中蛋白44
• 3.4.5 SEA親和層析組分生物信息學(xué)分析44-47
• 3.4.6 SEA親和層析組分糖蛋白分析47-49
• 3.4.7 SEA親和層析組分N-端糖基化預(yù)測(cè)49-51
• 3.5 討論51-53
• 第四章 日本血吸蟲P40的克隆表達(dá)及其作為早期診斷抗原的研究53-71
• 4.1 引言53
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料53-55
• 4.2.1 生物材料53
• 4.2.2 儀器設(shè)備53-54
• 4.2.3 酶和試劑54
• 4.2.4 試劑配方54-55
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法55-61
• 4.3.1 SjP40基因克隆及其相關(guān)生物信息學(xué)分析55-58
• 4.3.2 重組質(zhì)粒pET-28a(+)-SjP40的構(gòu)建與鑒定58-59
• 4.3.3 rSjP40的表達(dá)與純化59-60
• 4.3.4 Western Blotting分析rSjP40免疫原性60
• 4.3.5 rSjP40免疫應(yīng)答分析60-61
• 4.3.6 評(píng)估rSjP40作為診斷抗原的應(yīng)用價(jià)值61
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果61-69
• 4.4.1 SjP40的克隆及生物信息學(xué)分析61-65
• 4.4.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-SjP40鑒定65-66
• 4.4.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-SjP40誘導(dǎo)表達(dá)66
• 4.4.4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-SjP40純化66-67
• 4.4.5 Western Blot檢測(cè)rSjP40免疫原性67
• 4.4.6 rSjP40誘導(dǎo)BALB/c鼠體內(nèi)的特異性抗體檢測(cè)67-68
• 4.4.7 rSjP40作為診斷抗原的應(yīng)用價(jià)值68-69
• 4.5 討論69-71
• 第五章 全文結(jié)論71-72
• 參考文獻(xiàn)72-80
• 致謝80-81
• 作者簡(jiǎn)歷81

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：523523