本文關(guān)鍵詞：體內(nèi)細(xì)胞因子捕獲實(shí)驗(yàn)（IVCCA）測(cè)定日本血吸蟲感染后細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)變化及與肝纖維化關(guān)系的研究

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【摘要】：血吸蟲病是一種慢性蠕蟲性疾病,全球約有2億多患者。它主要是以肝、腸蟲卵肉芽腫和隨之伴隨的纖維化為主要特征的免疫病理性疾病。一般認(rèn)為CD4+T細(xì)胞亞群在抗血吸蟲感染及免疫調(diào)控過程中起著重要作用,其中輔助性細(xì)胞Th1、Th2是主要的效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T,Treg)在血吸蟲感染免疫病理機(jī)制中總體上起免疫下調(diào)作用;新近發(fā)現(xiàn)的Th17細(xì)胞也積極參與抗血吸蟲免疫反應(yīng)。隨著血吸蟲感染的進(jìn)程發(fā)展,以上四種CD4+T細(xì)胞亞群在數(shù)量及功能呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì),對(duì)感染發(fā)生、發(fā)展及纖維化病理進(jìn)程等起重要的調(diào)控作用。同時(shí),這些CD4+T細(xì)胞亞群之間也存在復(fù)雜的相互調(diào)節(jié)(cross-talk)。宿主感染血吸蟲后,機(jī)體的免疫應(yīng)答主要由Th1、Th2、Treg、Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子相互調(diào)控。在感染急性期,即感染后三周內(nèi),宿主要針對(duì)移行中的幼蟲及成蟲的免疫應(yīng)答。其主導(dǎo)型應(yīng)答為Th1細(xì)胞免疫,此種免疫應(yīng)答主要是由蟲體抗原及蟲體移行時(shí)機(jī)械創(chuàng)傷所致的急性免疫應(yīng)答。當(dāng)成蟲開始產(chǎn)卵時(shí),Th2免疫應(yīng)答逐漸增強(qiáng),并形成以肝臟肉芽腫為主要特征的病理性改變。同時(shí)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞也逐漸增殖活化,產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng),防止T細(xì)胞過度活化,使血吸蟲導(dǎo)致的炎性反應(yīng)逐漸減弱。隨著Th17細(xì)胞的發(fā)現(xiàn),越來越的研究揭示Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17在血吸蟲感染過程中具有重要的調(diào)控作用。無論是采用基因敲除還是抗體中和等手段來抑制Th17細(xì)胞活化及其分泌的細(xì)胞因子,均能明顯減小蟲卵肉芽腫體積和宿主炎癥反應(yīng)。因此,若能準(zhǔn)確地了解血吸蟲感染過程中上述免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化,將對(duì)調(diào)控血吸蟲感染而導(dǎo)致的肝纖維化病變具有重要意義。而目前檢測(cè)宿主感染血吸蟲后細(xì)胞因子變化的方法主要是通過體外刺激脾臟細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等來檢測(cè)細(xì)胞因子在蛋白質(zhì)、mRNA水平的變化,以此間接地反映感染過程中宿主體內(nèi)各種細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化。不過,上述方法只是反映某個(gè)器官的細(xì)胞體外細(xì)胞因子分泌水平,不能完整反映宿主體內(nèi)細(xì)胞因子的實(shí)際水平和變化。鑒于上述檢測(cè)方法的局限性,有人就提出體內(nèi)細(xì)胞因子捕獲實(shí)驗(yàn)(invivocytokinecaptureassay,ivcca),該方法不僅可以從宿主整體水平上檢測(cè)感染后各種細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化,而且其檢測(cè)靈敏性較高,可彌補(bǔ)上述檢測(cè)方法的不足。這對(duì)以后更深層次地探索細(xì)胞因子在血吸蟲感染過程中的作用和對(duì)感染過程中分泌量較少的細(xì)胞因子的檢測(cè)具有重要的意義。因此,本論文擬采用ivcca檢測(cè)日本血吸蟲感染后體內(nèi)細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化,并初步探討細(xì)胞因子與肝纖維化的關(guān)系。本研究?jī)?nèi)容主要分為以下兩個(gè)部分:第一部分ivcca的建立以及與體外檢測(cè)結(jié)果的比較目的:建立ivcca方法學(xué),檢測(cè)c57bl/6小鼠感染日本血吸蟲后,ifn-?、il-4、il-10及il-17的動(dòng)態(tài)變化,并與體外檢測(cè)結(jié)果比較。方法:建立小鼠感染日本血吸蟲模型:c57bl/6小鼠25只,雌性,6周齡,貼腹感染日本血吸蟲尾蚴15條/只。分別于感染后0、3、5、7、10和12周,隨機(jī)選取5只感染和3只未感染小鼠,分別用ivcca和elisa法檢測(cè)血清中ifn-?、il-4、il-10及il-17分泌量。人道處死小鼠并收集成蟲確保感染的一致性;無菌制備脾臟細(xì)胞懸液,分別用含anti-cd3/cd28和pma/ionomycin體外培養(yǎng)48小時(shí),elisa檢測(cè)上述細(xì)胞因子分泌水平;pma/ionomycin和golgistop體外培養(yǎng)6小時(shí),收集細(xì)胞做細(xì)胞內(nèi)因子染色檢測(cè),用于體外對(duì)照。結(jié)果:ivcca檢測(cè)方案具有可行性,ivcca血清檢測(cè)結(jié)果:小鼠血清中ifn-?分泌量于感染后持續(xù)增加,感染后?周(感染后不同時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較,下同)達(dá)到高峰(p0.05),之后逐漸下降并維持在較高的水平;il-4和il-17分泌量也于感染后持續(xù)增加,感染后?周達(dá)到高峰(p0.05),之后逐漸下降并維持在較高的水平;il-10的分泌量于感染后持續(xù)增加。而常規(guī)elisa檢測(cè)法卻未能在感染早期的鼠血清中檢測(cè)到上述細(xì)胞因子。體外脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清e(cuò)lisa和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測(cè)結(jié)果:anti-cd3/anti-cd28和pma/ionomycin刺激結(jié)果均表明,ifn-?、il-4、il-10及il-17分泌量均于感染后持續(xù)上升。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色結(jié)果也提示treg、th1、th2及th17細(xì)胞在脾臟總細(xì)胞中的比例均于感染后持續(xù)上升。結(jié)論:我們成功建立了體內(nèi)細(xì)胞因子捕獲實(shí)驗(yàn)(ivcca)檢測(cè)日本血吸蟲感染后細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化并與體外細(xì)胞培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果作了比較。ivcca具有敏感性高、能從宿主整體水平上動(dòng)態(tài)檢測(cè)感染后細(xì)胞因子的變化,且無須處死小鼠。本法為t細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在體內(nèi)免疫病理機(jī)制中的作用的研究提供了一個(gè)有用的工具;不僅可用于血吸蟲,也可用于其它寄生蟲、微生物感染的相關(guān)研究。第二部分日本血吸蟲感染后細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化與肝纖維化關(guān)系的研究目的:探討c57bl/6小鼠感染日本血吸蟲后細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化及與肝纖維化的關(guān)系。方法:建立小鼠感染日本血吸蟲模型,c57bl/6小鼠25只,雌性,6周齡,貼腹感染日本血吸蟲尾蚴15條/只。分別于感染后0、3、5、7、10和12周隨機(jī)選取5只小鼠,人道處死小鼠并收集成蟲。取肝臟(按其生理分頁),分別做石蠟病理切片he和masson三色染色、蟲卵計(jì)數(shù)、羥脯氨酸含量、實(shí)時(shí)定量pcr測(cè)定,如tgf-β、i型膠原蛋白(coli)及iii型膠原蛋白(coliii)。無菌制備脾臟細(xì)胞懸液,采用蟲卵可溶性抗原(solubleeggantigen,sea)體外培養(yǎng)72小時(shí)后,收集上清e(cuò)lisa檢測(cè)ifn-?、il-4、il-10及il-17分泌水平。結(jié)果:在感染后5周,發(fā)現(xiàn)肝臟中有蟲卵沉積,并且隨感染時(shí)間的延長(zhǎng),肝臟中蟲卵負(fù)荷逐漸增加。蟲卵肉芽腫于感染后7周面積最大(p0.05),之后逐漸縮小。masson三色染色結(jié)果顯示,感染后5周蟲卵周圍出現(xiàn)少量藍(lán)色的纖維條索,并隨感染時(shí)間的延長(zhǎng),藍(lán)色纖維條索逐漸增多,其變化趨勢(shì)與羥脯氨酸檢測(cè)結(jié)果的趨勢(shì)一致。tgf-β、coli及coliiimrna檢測(cè)結(jié)果顯示,tgf-?、coliii基因表達(dá)水平于感染后持續(xù)增加,在感染后7周達(dá)到高峰(p0.05),之后又逐漸下降,coli基因表達(dá)水平也于感染后持續(xù)增加,感染后10周達(dá)到高峰(p0.05),之后又逐漸下降。sea刺激脾臟細(xì)胞結(jié)果表明,ifn-?分泌量在感染后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均對(duì)sea呈低反應(yīng)性(p0.05);il-4分泌量在感染后5周內(nèi)對(duì)sea反應(yīng)不明顯,但在感染后7周分泌量顯著上升(p0.05),之后又逐漸下降;il-17分泌量于感染后5周開始上升,并于感染后7周時(shí)達(dá)到頂峰(p0.05),之后又逐漸下降;il-10分泌量于感染后持續(xù)增加。結(jié)論:c57bl/6小鼠感染血吸蟲后,隨著蟲卵在肝臟組織中的沉積,逐漸形成以蟲卵為中心的肉芽腫炎癥反應(yīng)。在感染后7周,炎癥反應(yīng)比其他檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)更為劇烈,蟲卵肉芽腫面積最大。隨后炎癥反應(yīng)開始逐漸減弱,蟲卵肉芽腫面積逐漸變小,蟲卵周圍浸潤的炎性細(xì)胞減少,取而代之的是大量膠原細(xì)胞。這與ivcca檢測(cè)結(jié)果中的il-4、il-10及il-17的變化趨勢(shì)一致。體外sea培養(yǎng)結(jié)果提示il-4、il-10及il-17均參與了肝臟蟲卵肉芽腫炎癥反應(yīng)及纖維化形成等免疫病理反應(yīng),sea可能直接活化th2,th17和Treg等T細(xì)胞亞群。而SEA不能顯著誘導(dǎo)Th1代表性細(xì)胞因子IFN-?的產(chǎn)生。以上結(jié)果提示感染后肝臟炎癥肉芽腫反應(yīng)在一定程度上反映了體內(nèi)抗炎性細(xì)胞因子(如TGF-?1和IL-10)和促炎性細(xì)胞因子(IL-17)相互作用的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果。感染7周后,體內(nèi)炎癥促進(jìn)因素逐漸減弱,抑制因素逐漸增強(qiáng)。從而使蟲卵肉芽腫面積減小,炎癥反應(yīng)減弱,轉(zhuǎn)向免疫調(diào)整(immunomodulation)狀態(tài)。
【關(guān)鍵詞】：日本血吸蟲 IVCCA 肝纖維化 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 蟲卵肉芽
【學(xué)位授予單位】：江蘇省血吸蟲病防治研究所
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R532.21
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-17
• 第一部分 IVCCA的建立以及與體外檢測(cè)結(jié)果的比較17-34
• 1 材料與試劑17-20
• 2 方法20-26
• 3 結(jié)果26-32
• 4 討論32-34
• 第二部分 日本血吸蟲感染后細(xì)胞因子動(dòng)的態(tài)變化與肝纖維化關(guān)系的研究34-52
• 1 材料與試劑34-36
• 2 方法36-43
• 3 結(jié)果43-50
• 4 討論50-52
• 全文小結(jié)52-53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 碩士在讀期間發(fā)表論文及參與課題56-57
• 致謝57

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 李石柱;鄭浩;高婧;張利娟;朱蓉;許靜;郭家鋼;肖寧;周曉農(nóng);;2012年全國血吸蟲病疫情通報(bào)[J];中國血吸蟲病防治雜志;2013年06期

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本文編號(hào)：519778