本文關(guān)鍵詞：乙型肝炎表面抗原主蛋白與烯酰輔酶A水合酶相互作用對(duì)細(xì)胞脂代謝影響的研究

  更多相關(guān)文章： 乙肝表面抗原主蛋白 烯酰輔酶A水合酶 HepG2 脂質(zhì)代謝

【摘要】：目的:通過(guò)在人肝癌細(xì)胞株Hep G2中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染乙型肝炎表面抗原主蛋白(small hepatitis b surface antigen,SHBs),觀察SHBs與烯酰輔酶A水合酶(enoyl Coa hydratase,ECHS1)相互作用對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝的影響,初步探導(dǎo)SHBs與ECHS1相互作用在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis b,CHB)患者發(fā)生肝脂肪變中的可能作用。為未來(lái)CHB合并脂肪肝分子機(jī)制的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。方法:1.以pc DNA3.1(+)質(zhì)粒為載體構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pc DNA3.1(+)-SHBs和pc DNA3.1(+)-ECHS1。2.建立SHBs瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型:將pc DNA3.1(+)-SHBs通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入Hep G2細(xì)胞中,同時(shí)設(shè)立未轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pc DNA3.1(+)作為對(duì)照,24h后通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase reaction,RT-PCR)法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)SHBs的表達(dá)。3.設(shè)計(jì)并合成針對(duì)ECHS1的si RNA序列插入到p Silencer載體中,通過(guò)脂質(zhì)體將插入ECHS1-si RNA陰性對(duì)照序列的p Silencer、pc DNA3.1(+)-ECHS1、插入了有效ECHS1干擾序列的p Silencer分別轉(zhuǎn)入已成功表達(dá)SHBs基因的Hep G2細(xì)胞中,同時(shí)設(shè)立未轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒Hep G2細(xì)胞和單純轉(zhuǎn)染SHBs的Hep G2細(xì)胞作為對(duì)照。4.轉(zhuǎn)染后48h用半定量RT-PCR和Western Blot分別從m RNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)ECHS1及脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況,并測(cè)定各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)液中的轉(zhuǎn)氨酶水平和細(xì)胞內(nèi)總膽固醇(total cholesterol,TC)及甘油三酯(triglyceride,TG)的含量,油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴蓄積情況。結(jié)果:1.成功建立Hep G2細(xì)胞SHBs的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染模型2.與未轉(zhuǎn)染Hep G2細(xì)胞相比,單純SHBs轉(zhuǎn)染組及SHBs+ECHS1-si RNA陰性序列對(duì)照組在核酸水平ECHS1、LPL、Apo A1表達(dá)分別下降,ACC表達(dá)升高,PPARα和CPT1A表達(dá)無(wú)明顯變化,蛋白水平的上述基因的表達(dá)趨勢(shì)同核酸基本一致,細(xì)胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)氨酶升高,細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量升高,甘油三酯含量下降。3.相比單純SHBs轉(zhuǎn)染組:在轉(zhuǎn)染了SHBs的Hep G2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ECHS1可在核酸和蛋白水平上調(diào)LPL的表達(dá)(P0.05),下調(diào)Apo A1、ACC和CPT1A的表達(dá)(P0.05),而對(duì)PPARα的表達(dá)無(wú)影響(P0.05);且細(xì)胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)氨酶水平、細(xì)胞內(nèi)TC及TG含量均下降。4.相比單純SHBs轉(zhuǎn)染組:在轉(zhuǎn)染了SHBs的Hep G2細(xì)胞中靶向下調(diào)ECHS1可在核酸水平下調(diào)LPL和Apo A1,上調(diào)ACC、CPT1A表達(dá),但Apo A1表達(dá)要高于ECHS1過(guò)表達(dá)組,而PPARα表達(dá)無(wú)明顯變化,蛋白水平的上述基因的表達(dá)趨勢(shì)同核酸基本一致,但CPT1A表達(dá)未升高,另外細(xì)胞培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)氨酶水平、細(xì)胞內(nèi)膽固醇及甘油三酯均升高。5.在所有轉(zhuǎn)染組Hep G2細(xì)胞中油紅O染色未觀察到明顯的脂滴蓄積。結(jié)論:SHBs可能損傷肝細(xì)胞,并通過(guò)干擾脂肪酸代謝中某些基因的表達(dá)影響細(xì)胞脂質(zhì)代謝,但這種效應(yīng)可能不是完全通過(guò)PPARα通路產(chǎn)生的,且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期內(nèi)未造成明顯的細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：乙肝表面抗原主蛋白 烯酰輔酶A水合酶 HepG2 脂質(zhì)代謝
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62
【目錄】：

• 英漢縮略詞對(duì)照表5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-12
• 前言12-15
• 材料和方法15-31
• 結(jié)果31-50
• 討論50-57
• 小結(jié)57-58
• 參考文獻(xiàn)58-67
• 綜述67-81
• 參考文獻(xiàn)75-81
• 致謝81

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本文編號(hào)：512750