本文關(guān)鍵詞：梅毒螺旋體金屬蛋白酶的表達(dá)及對(duì)纖維蛋白原水解活性研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:研究梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)金屬蛋白酶Tp0751對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)纖維蛋白原(Fg)的水解能力及其機(jī)制,為深入研究Tp的致病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:(1)Tp0751野生型和突變型蛋白原核表達(dá)、純化:從Genbank上查獲Tp0751的基因序列(不含信號(hào)肽氨基酸編碼序列),構(gòu)建野生型p ET30a(+)/Tp0751、p ET30a(+)/Tp0751 H198A突變型和p ET30a(+)/Tp0751 H202A突變型蛋白原核表達(dá)重組載體,重組質(zhì)粒在經(jīng)雙酶切、PCR和測(cè)序鑒定后被轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)菌中進(jìn)行重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá);采用Ni-NTA親和層析法純化目的蛋白,SDS-PAGE鑒定經(jīng)Ni-NTA純化的目的蛋白的表達(dá)形式,BCA法測(cè)定蛋白的濃度;Western blot鑒定經(jīng)Ni-NTA純化的目的蛋白。(2)野生型Tp0751蛋白體外水解人Fg能力檢測(cè):將Tp0751蛋白與Fg按比例混合(蛋白終質(zhì)量為30μg,Fg終質(zhì)量為60μg,反應(yīng)總體積為100μL),SDS-PAGE檢測(cè)Tp0751對(duì)Fg不同作用時(shí)間段的降解活性。(3)H198A突變型Tp0751蛋白體外水解人Fg能力檢測(cè):將H198A突變型Tp0751蛋白與Fg按比例混合(蛋白終質(zhì)量為30μg,Fg終質(zhì)量為60μg,反應(yīng)總體積為100μL),SDS-PAGE檢測(cè)H198A突變型Tp0751對(duì)Fg不同作用時(shí)間段的降解活性。(4)H202A突變型Tp0751蛋白體外水解人Fg能力檢測(cè):將H202A突變型Tp0751蛋白與Fg按比例混合(蛋白終質(zhì)量為30μg,Fg終質(zhì)量為60μg,反應(yīng)總體積為100μL),SDS-PAGE檢測(cè)H202A突變型Tp0751對(duì)Fg不同作用時(shí)間段的降解活性。結(jié)果:(1)Tp0751蛋白原核表達(dá)、純化:酶切及測(cè)序結(jié)果表明重組野生型p ET30a(+)/Tp0751質(zhì)粒的插入片段序列與Gen Bank上面公布的序列完全一致,經(jīng)兩點(diǎn)法構(gòu)建的突變型重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;該插入片段能夠表達(dá)26KDa大小的可溶性重組蛋白,該重組蛋白經(jīng)純化后的純度達(dá)到90%;該重組蛋白的Western blot結(jié)果表明,其與梅毒陽(yáng)性病人的免疫血清產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)。(2)Tp0751蛋白對(duì)Fg水解能力檢測(cè):Tp0751蛋白具有水解Fg的能力,在反應(yīng)持續(xù)24小時(shí)后Fg基本上被水解完全。(3)H198A突變型Tp0751蛋白體外水解人Fg能力檢測(cè):H198A突變型Tp0751蛋白具有一定的水解Fg能力,在反應(yīng)持續(xù)24小時(shí)后Fg部分被水解。(4)H202A突變型Tp0751蛋白體外水解人Fg能力檢測(cè):H202A突變型Tp0751未表現(xiàn)出明顯的水解Fg的能力,在反應(yīng)持續(xù)24小時(shí)后Fg基本未被水解。結(jié)論:(1)Tp0751重組蛋白具有水解Fg的能力;(2)Tp0751蛋白HEXXH域的突變能抑制Tp0751蛋白降解Fg的能力;H198EXXH202結(jié)構(gòu)域中影響Tp0751蛋白降解Fg的位點(diǎn)可能是202位的H而不是198位的H。
【關(guān)鍵詞】：梅毒螺旋體 金屬蛋白酶 Tp0751 水解活性 致病機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R759.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 主要中英文縮寫(xiě)10-11
• 第1章 前言11-13
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料13-17
• 2.1 菌株和質(zhì)粒13
• 2.2 血清標(biāo)本及來(lái)源13
• 2.3 儀器設(shè)備13-14
• 2.4 主要試劑14-17
• 第3章 實(shí)驗(yàn)方法17-30
• 第一部分 Tp0751 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及 Tp0751 重組蛋白的鑒定17-25
• 3.1 Tp0751 基因的擴(kuò)增17-18
• 3.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定18-23
• 3.3 Tp0751 重組蛋白的制備23-25
• 第二部分 梅毒螺旋體金屬蛋白酶對(duì)纖維蛋白原水解活性研究25-30
• 3.4 野生型 Tp0751（wt-Tp0751）水解纖維蛋白原的活性25-27
• 3.5 H198A 突變型 Tp0751 蛋白體外水解人 Fg 的活性研究27-28
• 3.6 H202A 突變型 Tp0751 蛋白體外水解人 Fg 的活性研究28-30
• 第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-36
• 4.1 Tp0751 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及 Tp0751 重組蛋白的鑒定30-32
• 4.2 梅毒螺旋體金屬蛋白酶對(duì)纖維蛋白原水解活性研究32-36
• 第5章 討論36-40
• 第6章 結(jié)論40-42
• 參考文獻(xiàn)42-45
• 文獻(xiàn)綜述45-53
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 科研成果53-54
• 致謝54

【相似文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：梅毒螺旋體金屬蛋白酶的表達(dá)及對(duì)纖維蛋白原水解活性研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：509647