本文關(guān)鍵詞：田鼠巴貝蟲病分子調(diào)查及其診斷抗原高通量篩選，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:對(duì)中緬邊境地區(qū)發(fā)熱人群田鼠巴貝蟲(Babesia microti)感染情況調(diào)查及田鼠巴貝蟲病相關(guān)診斷抗原候選分子高通量篩選鑒定。方法:1)首先對(duì)2014年6~8月期間在中緬邊境地區(qū)收集的200份排除瘧疾感染發(fā)熱病人的全血血樣提取DNA,然后應(yīng)用基于田鼠巴貝蟲18srRNA序列與微管蛋白序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增和測序分析鑒定田鼠巴貝蟲感染情況。2)基于田鼠巴貝蟲公共數(shù)據(jù)庫篩選分泌蛋白、重復(fù)序列和PiroplasmaDB公開數(shù)據(jù)庫中部分田鼠巴貝蟲與惡性瘧原蟲、牛巴貝蟲同源序列篩選構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫,從田鼠巴貝蟲(Babesia microti ATCC#174;PRA-99TM)感染的BALB/c小鼠血液中提取田鼠巴貝蟲RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以田鼠巴貝蟲cDNA為模板擴(kuò)增目的基因片段。利用無縫克隆技術(shù)連接目的基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pEU-His,經(jīng)過重組質(zhì)粒的鑒定,最后獲得含有目的基因片段的表達(dá)質(zhì)粒。利用試劑盒提取重組質(zhì)粒后,采用麥胚無細(xì)胞蛋白表達(dá)體系進(jìn)行表達(dá),用western-blot技術(shù)分析鑒定出表達(dá)正確的蛋白。通過蛋白芯片技術(shù)用不同感染時(shí)期鼠血清對(duì)表達(dá)正確的蛋白進(jìn)行高通量篩選。結(jié)果:1)在200份發(fā)熱病人巢式PCR檢測有2份病人全血經(jīng)兩種巢式PCR和測序分析鑒定為田鼠巴貝蟲感染,并經(jīng)進(jìn)化序列分析為人獸共患型田鼠巴貝蟲株。2)篩選222個(gè)目的基因片段構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫,PCR成功擴(kuò)增了215個(gè)片段,無縫克隆成功構(gòu)建了186個(gè)重組質(zhì)粒,麥胚無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)成功表達(dá)了167個(gè)重組蛋白。以感染田鼠巴貝蟲的BALB/c小鼠不同時(shí)期血清為抗體,利用蛋白芯片技術(shù)從167個(gè)重組抗原中篩選出10個(gè)重組抗原,分別是:BmSP44、BmRS8、BmRS21、BmRS28、BmRS29、BmHP33、BmHP37、BmHP41、BmHP42和BmHP43。結(jié)論:在我國云南省中緬邊境地區(qū)存在可感染人和其他哺乳動(dòng)物的田鼠巴貝蟲;用感染田鼠巴貝蟲的BALB/c小鼠不同感染時(shí)期血清共篩選出10個(gè)重組抗原,但其應(yīng)用于人田鼠巴貝蟲感染的診斷還需進(jìn)一步驗(yàn)證。
【關(guān)鍵詞】：田鼠巴貝蟲 巢式PCR 診斷 無縫克隆 麥胚無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng) 重復(fù)序列
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R531
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 引言10-18
• 1.巴貝蟲的感染過程12
• 2.巴貝蟲病的流行與防治12-13
• 3.巴貝蟲病的診斷13-17
• 3.1 病原診斷技術(shù)13-14
• 3.2 分子生物學(xué)診斷技術(shù)14-15
• 3.3 免疫學(xué)診斷技術(shù)15-17
• 4. 本研究的目的和意義17
• 5. 本研究的主要內(nèi)容17
• 6. 本研究的技術(shù)路線17-18
• 第一部分 云南省中緬邊境地區(qū)發(fā)熱病人田鼠巴貝蟲感染情況的分子調(diào)查18-28
• 1、材料與方法18-22
• 1.1 發(fā)熱病例的來源18
• 1.2 主要儀器和設(shè)備18-19
• 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和溶液配方19-20
• 1.4 巢式PCR檢測20-22
• 1.5 分子鑒定陽性血樣血涂片Giemsa染色觀察22
• 1.6 測序結(jié)果分析22
• 2、結(jié) 果22-26
• 3、討 論26-28
• 第二部分 田鼠巴貝蟲基因的克隆、表達(dá)和診斷抗原的高通量篩選28-64
• 1、材料與方法29-47
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料來源29
• 1.2 主要儀器和設(shè)備29-31
• 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和溶液配方31-34
• 1.4 cDNA的制備34-35
• 1.5 PCR引物的設(shè)計(jì)35-37
• 1.6 載體線性化37-39
• 1.7 目的基因的擴(kuò)增39-40
• 1.8 無縫克隆40-41
• 1.9 抽提質(zhì)粒41-42
• 1.10 目的基因的表達(dá)42-43
• 1.11 重組蛋白的免疫印跡分析43-45
• 1.12 重組蛋白的高通量篩選45-47
• 2、結(jié)果47-62
• 2.1 基因片段篩選47-51
• 2.2 PCR引物的設(shè)計(jì)51
• 2.3 載體線性化51-52
• 2.4 目的基因的擴(kuò)增52-54
• 2.5 無縫克隆54-56
• 2.6 免疫印跡（western-blot）鑒定無細(xì)胞表達(dá)的蛋白56-59
• 2.7 重組蛋白的高通量篩選59-62
• 3、討 論62-64
• 全文總結(jié)64-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 英文縮略詞表72-73
• 本研究所獲得的基金資助73-74
• 研究成果74-75
• 攻讀學(xué)位期間其他科研成果75-76
• 致謝76-77
• 附錄77-96

【相似文獻(xiàn)】

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