本文關(guān)鍵詞：基于高通量測序的病原體篩查與確認(rèn)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：新發(fā)突發(fā)傳染病是全世界面臨的一個重要威脅,諸如氣候變暖、人口增長、抗生素濫用、經(jīng)濟全球化、世界都市化、自然生態(tài)環(huán)境改變、人和野生動物接觸頻繁、跨國旅行人口數(shù)量激增及速度加快等因素,都極大增加了新發(fā)傳染病發(fā)生和傳播的可能性。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)的統(tǒng)計,自1973年以來,人類已發(fā)現(xiàn)至少48種新的病原體,例如人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)、重癥急性呼吸綜合征病毒(Severe acute respiratory syndrome,SARS)、埃博拉病毒、馬爾堡病毒、禽流感病毒和豬流感病毒等。新型傳染病正以平均每年新增一種的速度發(fā)生,并跨越國境在全球范圍傳播。因此對新發(fā)、突發(fā)傳染病病原體進行快速篩查和確認(rèn),在最短的時間內(nèi)獲得病原體信息,是有效控制疫情和應(yīng)對突發(fā)生物危害事件的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的病原體鑒定技術(shù)在病原體感染檢測方面已日趨乏力。隨著聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術(shù)的出現(xiàn),臨床上基于核酸檢測的病原體鑒定技術(shù)已經(jīng)顯著提高了檢測成功率。最常見的基于PCR技術(shù)的檢測方法需要病原體的基因組序列信息。然而,并不是在所有情況下病原體基因組序列信息都是已知的。針對先前并無相關(guān)報道,也未曾在人類中發(fā)現(xiàn)過的新型病原體,缺少相關(guān)的基因組序列信息,這限制了對該病原體導(dǎo)致疫情的檢測。在實際情況中,在疾病診斷時,未知病原體感染占據(jù)很高的比例。近年來,越來越多對人類健康有重大意義的新型病原體,通過高通量測序技術(shù)得以發(fā)現(xiàn),而傳統(tǒng)的生物技術(shù)手段卻未曾發(fā)現(xiàn)它們的存在,這提示高通量測序技術(shù)在病原微生物發(fā)現(xiàn)方面是一種新穎、有效的手段。高通量測序技術(shù)的發(fā)展使得對復(fù)雜微生物標(biāo)本的研究成為可能,為洞察包括海洋、土壤以及人體等在內(nèi)的不同來源樣本的微生物群落多樣性提供全新的視野。這些研究方法包括兩種手段,一種是基于16S rDNA基因測序方法以確定系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系;更多的是另一種方法,基于大規(guī)模Shotgun測序方法,研究樣本中物種組成以及基因多態(tài)性。16S rDNA分子中,不僅含有高度和中度保守的序列區(qū)域,又含有高度變化的序列區(qū)域,而且其片段長度約1 540 bp,既便于分析,又含有足夠多的信息,因此16S rDNA基因測序可用于復(fù)雜標(biāo)本中細(xì)菌親緣關(guān)系的研究。而全基因組測序,則可針對遺傳進化特征、個體基因差異、致病機理、耐藥機制及其傳播規(guī)律進行研究。新一代高通量技術(shù)所需要的測序時間大大縮短,同時成本也越來越低,跨越了傳統(tǒng)生物學(xué)研究方法所不能逾越的鴻溝,為比較基因組學(xué)、流行病學(xué)和微生物演化研究掀開嶄新一頁。近些年,人獸共患病發(fā)病人數(shù)一直居于傳染病人數(shù)的前列,sars、狂犬病、禽流感等人獸共患病,對人類健康和公共衛(wèi)生安全造成巨大的威脅。由猴皰疹病毒(simianvaricellavirus,svv)引起的猴水痘(simianvaricella,sv)疾病,在臨床上與人類水痘帶狀皰疹病毒(varicella-zostervirus,vzv)感染有相似的癥狀,已有研究證實svv和vzv之間具有抗原相關(guān)性,因此對svv進行深入研究是十分必要的。2014年某動物中心飼養(yǎng)的非洲綠猴發(fā)生未知疫情,導(dǎo)致多只綠猴死亡。本研究采用高通量測序探究該疫情的致死因素。本實驗取死亡綠猴的肝、肺組織樣品,提取病毒總dna,基于病毒宏基因組學(xué)技術(shù),使用iontorrentpgm平臺進行高通量測序,并借助生物信息學(xué)方法分析測序數(shù)據(jù)中的病毒組,尋找綠猴死亡可能的致死因素;根據(jù)高通量測序篩查結(jié)果設(shè)計引物,對樣本進行qpcr定量檢測,進一步確認(rèn)組織樣品中病毒的存在。對死亡綠猴的組織樣品測序共產(chǎn)生原始測序數(shù)據(jù)共674mb,讀序(reads)數(shù)達到4.76m條,通過序列拼接,獲得了該病毒長約124kb的全基因組序列。序列比對發(fā)現(xiàn),測序數(shù)據(jù)中有大量的序列與猴水痘帶狀皰疹病毒具有高度的同源性,與目前已知的猴皰疹病毒9型的同源性達到98%以上。根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計猴皰疹病毒特異性引物,采用qpcr對標(biāo)本和病毒純培養(yǎng)物進行定量檢測,肝臟、肺臟和病毒培養(yǎng)物的ct值分別為23、20和16,可見兩組織中均存在大量病毒,肺組織中的猴皰疹病毒滴度較肝組織高。本研究采用高通量測序作為傳染病疫情的快速篩查技術(shù),確認(rèn)此次綠猴死亡的致死病原體為猴水痘帶狀皰疹病毒。新發(fā)傳染病中,除由病毒引發(fā)的傳染病,還有一類為細(xì)菌引起的感染。由于細(xì)菌與病毒結(jié)構(gòu)不同,因而標(biāo)本采取的處理方式也不同。某實驗動物中心在一次動物實驗中,發(fā)現(xiàn)一例食蟹猴非正常死亡,死亡原因未知,本研究采用高通量測序技術(shù)對未知致死病原體進行檢測。本實驗直接對病變腦組織樣品進行細(xì)菌核酸提取和16srdna的v1-v2區(qū)擴增,通過宏基因組學(xué)測序及生物信息學(xué)分析,在不依賴培養(yǎng)手段的情況下,短時間內(nèi)獲取病變腦組織的菌群構(gòu)成。然后,對腦組織勻漿物進行分離培養(yǎng),分離得到的2株細(xì)菌經(jīng)16srdna一代測序進行種屬鑒定,隨后完成shotgun測序和mate-pair大片段庫測序。在獲得全基因組后,利用rast進行基因組注釋,分析基因組上可能存在的毒力基因和耐藥基因,最后通過動物實驗驗證2株細(xì)菌的毒力。宏基因組測序結(jié)合組織病理學(xué)的檢查結(jié)果,提示導(dǎo)致食蟹猴死亡可能是由于致病細(xì)菌的感染作用。分離培養(yǎng)得到的2株細(xì)菌經(jīng)一代測序鑒定為巨型球菌和巴黎鏈球菌,進行基因組shotgun測序,巴黎鏈球菌測序數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接獲得27個contigs,與參考序列streptococcuslutetiensis033(genbank:cp003025.1)同源性達98%;巨型球菌測序數(shù)據(jù)拼接后得到28個contigs,與參考序列macrococcuscaseolyticus(genbank:ap009484.1)比對,發(fā)現(xiàn)其同源性僅為74%,認(rèn)為分離培養(yǎng)的巨型球菌為一個新種。對巨型球菌基因組進行Mate-Pair測序,獲得基因組全序,全長為2 391 704 bp,借助RAST注釋,得到其基因組中含有2 430個CDS,73個RNA,并發(fā)現(xiàn)了其中疑似的ClpP、ClpX、ResD等9個毒力基因,以及抗四環(huán)素、氨基糖苷類、氟喹諾酮、利福平等6個耐藥基因。最后通過細(xì)菌的BALB/c小鼠顱內(nèi)注射,與大腸工程菌對照組相比,巨型球菌和巴黎鏈球菌均存在較高致病性,可致小鼠死亡。上述研究結(jié)果顯示,巨型球菌和巴黎鏈球菌的混合感染可能與食蟹猴的死亡相關(guān),但具體的疾病發(fā)生過程以及致死機制的闡明仍需要后續(xù)的深入研究。
【關(guān)鍵詞】：病原體篩查與確認(rèn) 宏基因組測序 全基因組測序 基因組學(xué)
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R51;R440
【目錄】：

• 縮略詞表5-7
• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-19
• 1. 研究背景13
• 2. 高通量測序概述及應(yīng)用13-16
• 2.1 罕見病的基因組測序13-14
• 2.2 癌癥基因組測序14-15
• 2.3 高通量測序在新病原體發(fā)現(xiàn)方面的應(yīng)用15-16
• 3. 目前高通量測序技術(shù)的局限性16
• 4. 高通量測序技術(shù)的未來16-17
• 5. 立題依據(jù)17
• 6. 本文研究內(nèi)容17-19
• 第一章 未知病毒感染的高通量篩查與確認(rèn)19-33
• 1. 材料與方法20-24
• 1.1 實驗材料20
• 1.2 組織切片的制備和觀察20-21
• 1.3 樣本制備21
• 1.4 病毒總核酸提取21
• 1.5 DNA測序文庫構(gòu)建及測序21-23
• 1.6 生物信息學(xué)分析23
• 1.7 病毒的細(xì)胞培養(yǎng)23
• 1.8 病毒純培養(yǎng)物基因組的提取23-24
• 1.9 實時定量PCR檢測24
• 2. 實驗結(jié)果24-32
• 2.1 病毒基因組質(zhì)控結(jié)果24
• 2.2 Bioanalyzer 2100鑒定結(jié)果24-25
• 2.3 測序結(jié)果概述25
• 2.4 病毒基因組拼接和分析25-29
• 2.5 實時定量PCR檢測結(jié)果29-31
• 2.6 病理組織檢查31-32
• 3. 討論32
• 4. 結(jié)論32-33
• 第二章 未知細(xì)菌感染的高通量測序篩查與確認(rèn)33-58
• 1. 材料和方法33-41
• 1.1 實驗材料33-34
• 1.2 組織切片的制備和觀察34-35
• 1.3 樣本前期制備35
• 1.4 微生物的核酸提取35-37
• 1.5 RNA測序文庫構(gòu)建及測序37-38
• 1.6 16S rDNA V1-V2區(qū)擴增38
• 1.7 組織的宏基因組測序38-39
• 1.8 細(xì)菌純培養(yǎng)及鑒定39
• 1.9 細(xì)菌的全基因組測序39-41
• 1.10 動物實驗41
• 2. 實驗結(jié)果41-56
• 2.1 病理學(xué)檢查41-42
• 2.2 微生物核酸質(zhì)檢42
• 2.3 RNA-seq42-44
• 2.4 16S rDNA的V1-V2高變區(qū)擴增44
• 2.5 宏基因組測序44-47
• 2.6 細(xì)菌純培養(yǎng)及鑒定47-49
• 2.7 全基因組測序49-55
• 2.8 動物實驗55-56
• 3. 討論56-57
• 4. 結(jié)論57-58
• 全文總結(jié)58-59
• 參考文獻59-65
• 個人簡介65-66
• 致謝66

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