本文關(guān)鍵詞：Dectin-1重組腺病毒對(duì)侵襲性肺曲霉病免疫保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景真菌廣泛分布在我們生活的環(huán)境中,曲霉占空氣中真菌的12%左右。正常人體每天都能吸入一定量的真菌孢子,但是由于機(jī)體存在完善的免疫防御機(jī)制,能很好的清除進(jìn)入體內(nèi)的孢子,所以免疫力正常的人群不易罹患侵襲性真菌病。但是,近年來由于腫瘤化療和器官移植等免疫缺陷患者增多以及廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等的廣泛使用,導(dǎo)致侵襲性真菌感染發(fā)病率逐年增加。來自我國的一項(xiàng)多中心研究發(fā)現(xiàn),根據(jù)目前公認(rèn)的侵襲性真菌感染的確診和臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),在非血液惡性疾病患者中位于前7位的肺真菌病依次為肺曲霉病、肺念珠菌病、肺隱球菌病、肺孢子菌病、肺毛霉病、肺馬內(nèi)菲青霉病、組織胞漿菌病。侵襲性肺曲霉病的主要病理改變?yōu)榍咕z在肺組織內(nèi)增殖并侵入血管,導(dǎo)致壞死性血管炎,造成血栓和出血,導(dǎo)致血行播散。侵襲性肺曲霉病病情發(fā)展迅速,病死率高。即使通過不斷改進(jìn)檢測手段早期診斷,采取預(yù)防性治療和經(jīng)驗(yàn)性治療等措施,其病死率仍高達(dá)50%-90%。盡管近年抗真菌藥物研究取得很大進(jìn)步,但仍面臨治療有效率低和耐藥菌不斷產(chǎn)生等問題。當(dāng)前免疫治療已成為感染性疾病的重要防治手段之一。目前臨床上已開始一些免疫調(diào)節(jié)治療以輔助抗真菌治療,包括給予粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素(INF)-γ等,并取得了一定的療效。對(duì)機(jī)體免疫防御反應(yīng)研究的不斷深化,宿主天然免疫功能及其組成的免疫屏障在煙曲霉感染過程中發(fā)揮的防御作用逐步受到重視,將促使更多的研究從干預(yù)宿主免疫功能的角度,為侵襲性曲霉病防治提供新的思路。天然免疫對(duì)病原體的識(shí)別是非特異性的,主要依賴于模式識(shí)別受體去識(shí)別病原體表面共有的高度保守的分子結(jié)構(gòu)(病原相關(guān)分子模式)。Toll樣受體(TLRs)和C型凝集素受體(CLRs)家族是參與抗真菌免疫的主要模式識(shí)別受體。樹突狀細(xì)胞相關(guān)性C型凝集素-1(Dectin-1)屬于CLRs家族中研究最為廣泛和深入的。Dectin-1受體首先在巨噬細(xì)胞表面被發(fā)現(xiàn),廣泛分布于巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等表面。Dectin-1受體可以識(shí)別并結(jié)合煙曲霉細(xì)胞壁成分p-葡聚糖。在細(xì)胞水平阻斷Dectin-1受體,中性粒細(xì)胞與煙曲霉孢子共孵育后,顯示更低的炎癥因子表達(dá),更高的真菌負(fù)荷。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也提示,Dectin-1基因敲除小鼠在煙曲霉感染后期炎癥因子、真菌負(fù)荷及死亡率均明顯升高。既往上皮細(xì)胞被認(rèn)為僅僅起到免疫屏障的作用,但隨著研究的深入,人們已了解上皮細(xì)胞能夠和骨髓來源的細(xì)胞一樣通過表面的模式識(shí)別受體對(duì)病原體進(jìn)行識(shí)別,并誘導(dǎo)免疫反應(yīng),產(chǎn)生一些炎癥因子及抗菌物質(zhì)。消化道粘膜上皮細(xì)胞在受到病原體入侵時(shí),能上調(diào)表達(dá)TLRs等,產(chǎn)生抗菌肽和細(xì)胞因子等免疫分子,發(fā)揮積極抗菌作用。未受煙曲霉孢子刺激的情況下,氣道上皮細(xì)胞膜表面Dectin-1表達(dá)水平低,煙曲霉孢子刺激后能夠啟動(dòng)表達(dá)Dectin-1受體,通過siRNA沉默Dectin-1表達(dá)后,證明Dectin-1的上調(diào)表達(dá)在炎癥趨化因子、抗菌肽和活性氧釋放過程中發(fā)揮重要作用。隨著許多關(guān)于基因治療的動(dòng)物研究及臨床試驗(yàn)研究成功開展,使得基因治療在疾病治療方面的應(yīng)用得到廣泛關(guān)注。目前基因治療的載體主要分為病毒載體和非病毒載體,病毒載體相較于非病毒載體轉(zhuǎn)染效率高。腺病毒載體又由于具有可以轉(zhuǎn)染非分裂期細(xì)胞,遺傳毒性低,對(duì)肺組織具有親嗜性等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病基因治療的研究�；贒ectin-1在抗曲霉免疫中的重要作用和腺病毒載體基因治療的廣泛應(yīng)用。本研究通過氣管內(nèi)注射給藥的方式將Dectin-1重組腺病毒載體投送至小鼠肺部以構(gòu)建Dectin-1氣道上調(diào)表達(dá)小鼠模型,通過免疫組化及Real-timePCR技術(shù)驗(yàn)證Dectin-1表達(dá),并對(duì)給予載體后安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。同時(shí),進(jìn)一步研究Dectin-1重組腺病毒載體在煙曲霉感染中的作用,并通過測定炎癥因子、組織病理、真菌負(fù)荷、生存時(shí)間等方面評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)作用。第一部分Dectin-1重組腺病毒小鼠體外表達(dá)模型的鑒定及安全性研究目的采用氣管內(nèi)注射給予Dectin-1重組腺病毒的方法建立氣道Dectin-1上調(diào)表達(dá)小鼠模型,進(jìn)一步驗(yàn)證模型和評(píng)價(jià)其安全性。方法BALB/c小鼠分為PBS組、Ad-EGFP(recombinant adenovirus encoding enhanced green fluorescent protein)組、Ad-mDectin-1(recombinant adenovirus encoding murine Dectin-1)組,分別經(jīng)氣管給予PBS、Ad-EGFP、 Ad-mDectin-1.PBS組及Ad-EGFP組為對(duì)照組。在給藥后第3d,通過Real-time PCR檢測各組肺組織Dectin-1 mRNA水平,通過免疫組化檢測各組肺組織Dectin-1蛋白分布及表達(dá)水平,通過ELISA檢測各組肺組織勻漿及血液中白細(xì)胞介素(IL)-6水平,通過激光共聚焦檢測腺病毒載體在肺組織及肝臟的分布情況。繼續(xù)通過免疫組化檢測在給藥后第5、7、14d各組肺組織Dectin-1水平變化。通過Image-Pro Plus 6.0分析氣管壁Dectin-1積分光密度變化情況。結(jié)果通過采用氣管內(nèi)給藥方式,在第3d可以觀察到Ad-mDectin-1組小鼠肺組織Dectin-1 mRNA水平約為PBS組、Ad-EGFP組的18倍。Ad-mDectin-1組與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組,P=0.012；Ad-mDectin-1組vsPBS組,P=0.011)。對(duì)照組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.994)。在經(jīng)氣道給藥后第3、5、7、14d,Ad-mDectin-1組可觀察到Dectin-1主要定位于細(xì)支氣管,可見棕黃色陽性顆粒位于胞漿及胞膜。而肺泡上皮未發(fā)現(xiàn)明顯陽性顆粒沉著。對(duì)照組均未見肺上皮細(xì)胞有棕黃色陽性顆粒沉著。在Ad-mDectin-1組中可以觀察到Dectin-1水平逐漸增高,在第5d達(dá)高峰,第14d氣道上皮細(xì)胞仍有Dectin-1表達(dá)。通過Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),平均光密度值從第3d開始上升,并在第5d達(dá)高峰,第14d明顯下降。各時(shí)間點(diǎn)比較發(fā)現(xiàn)第5、7d與第3、14d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(第5、7d vs 第3、14d,P0.001)。在給藥后第3d,通過激光共聚焦顯微鏡觀察Ad-mDectin-1在全身的分布情況。結(jié)果顯示在肺組織中Ad-mDectin-1組及Ad-EGFP組均可發(fā)現(xiàn)綠色熒光,而PBS組肺組織未見綠色熒光。在肝臟組織中,各組均未發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白。肺組織及血清中工L-6水平顯示,Ad-mDectin-1組IL-6水平較PBS及Ad-EGFP對(duì)照組無明顯差異(Ad-mDectin-1組 vs PBS組,P=0.875; Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組,P=0.598)。同時(shí)檢測血清中IL-6水平未見明顯變化。結(jié)論通過氣管內(nèi)給予Ad-mDectin-1成功上調(diào)小鼠肺組織Dectin-1水平,Dectin-1主要表達(dá)于細(xì)支氣管上皮細(xì)胞,表達(dá)高峰在第5d,可持續(xù)2w以上。同時(shí)給予Ad-mDectin-1后對(duì)小鼠生存和活動(dòng)無明顯影響,未造成明顯炎癥反應(yīng)及遠(yuǎn)隔器官肝臟的播散。第二部分Dectin-1重組腺病毒對(duì)侵襲性肺曲霉病的免疫保護(hù)作用目的通過預(yù)先給予Dectin-1重組腺病毒,研究其對(duì)小鼠侵襲性肺曲霉病的免疫保護(hù)作用。方法BALB/c小鼠分為PBS組、Ad-EGFP組、Ad-mDectin-1組,分別醛氣管給予PBS、Ad-EGFP、Ad-mDectin-1。PBS組及Ad-EGFP組為對(duì)照組。1d后經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺構(gòu)建免疫缺陷小鼠,4d后建成免疫缺陷小鼠模型,此時(shí)經(jīng)氣管給予3×105pfu煙曲霉孢子。給予曲霉孢子后第二天收集肺組織及肺泡灌洗液。應(yīng)用ELISA檢測肺組織及肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子(TNF)-a及GM-CSF水平；Real-time PCR檢測肺組織Dectin-1 mRNA、IL-1β mRNA及IL-10 mRNA水平；HE染色及六胺銀(GMS)染色分析肺組織炎癥變化及肺部真菌水平；平板菌落計(jì)數(shù)評(píng)估各組真菌負(fù)荷；肺組織髓過氧化物酶(MPO)活力檢測分析肺組織中性粒細(xì)胞水平；并進(jìn)一步研究給予Ad-mDectin-1對(duì)煙曲霉感染小鼠生存率的影響。結(jié)果ELISA檢測發(fā)現(xiàn)各組肺組織及肺泡灌洗液中TNF-α水平無明顯差異(肺組織中P=0.215,肺泡灌洗液中P=0.906),而Ad-mDectin-1組GM-CSF水平在肺組織和肺泡灌洗液中均較對(duì)照組升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(肺組織中：Ad-mDectin-1組vs PBS組,P0.001；Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組,P0.001。肺泡灌洗液中：Ad-mDectin-1組vs PBS組,P=0.002；Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組,P=0.003)。Real-time PCR檢測各組肺組織中Dectin-1、IL-1β、IL-10水平。Ad-mDectin-1組肺組織Dectin-lmRNA水平高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ad-mDectin-1組vs PBS組,P=0.043；Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組,P=0.031)。肺組織IL-1β mRNA水平在Ad-mDectin-1組(7.8087±1.6716)明顯升高,約為對(duì)照組IL-1β mRNA水平(PBS組：2.6247±0.9735：Ad-EGFP組：3.0693±1.6587)的2.7倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ad-mDectin-1組vs PBS組,P0.001；Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組,P0.001)。肺組織IL-lOmRNA水平,Ad-mDectin-1組與對(duì)照組無明顯差異(P=0.997)。HE染色提示Ad-mDectin-1組的小鼠肺組織表現(xiàn)出更明顯的炎癥反應(yīng),肺泡間隔增厚,炎性細(xì)胞滲出明顯,并可觀察到紅細(xì)胞滲出,GMS染色顯示Ad-mDectin-1組肺組織中的真菌數(shù)量也較對(duì)照組明顯減少。相對(duì)于PBS組及Ad-EGFP組,Ad-mDectin-1組肺組織中孢子和菌絲的數(shù)量明顯減少。通過肺組織平板菌落計(jì)數(shù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論,Ad-mDectin-1組真菌負(fù)荷(5.7657±0.144)約為對(duì)照組(PBS組：6.0721±0.198；Ad-EGFP組：6.0721±0.227)的38.15%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ad-mDectin-1組vs PBS組,P=0.007；Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組,P=0.007)。肺組織MPO檢測提示,Ad-mDectin-1組小鼠肺組織MPO活力(0.3987±0.055)較PBS組(0.2964±0.026)及Ad-EGFP組(0.3011±0.033)明顯升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ad-mDectin-1組vs PBS組,P=0.03；Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組,P=0.036)。生存分析結(jié)果顯示PBS組的生存率為50%,Ad-EGFP組的生存率為60%,Ad-mDectin-1組無小鼠死亡,生存率為100%。各組之間比較提示Dectin-1生存率相對(duì)于對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Ad-mDectin-1組vs PBS組,P=0.012;Ad-mDectin-1組vs Ad-EGFP組,P=0.029;PBS組vs Ad-EGFP組,P=0.796)。結(jié)論Ad-mDectin-1能夠通過上調(diào)氣道Dectin-1表達(dá)后提高煙曲霉感染小鼠肺組織IL-1β及GM-CSF水平,募集大量中性粒細(xì)胞向肺內(nèi)感染病灶聚集,減輕肺內(nèi)真菌負(fù)荷,提高煙曲霉感染生存率。
【關(guān)鍵詞】：Dectin-1 腺病毒載體 基因治療 侵襲性肺曲霉病 天然免疫
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R519.8
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 前言19-30
• 參考文獻(xiàn)25-30
• 第一章 Dectin-1重組腺病毒小鼠體外表達(dá)模型鑒定及安全性研究30-49
• 材料30-31
• 方法31-37
• 結(jié)果37-43
• 討論43-46
• 結(jié)論46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 第二章 Dectin-1重組腺病毒對(duì)侵襲性肺曲霉病免疫保護(hù)作用49-69
• 材料49-51
• 方法51-55
• 結(jié)果55-60
• 討論60-64
• 結(jié)論64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 全文總結(jié)69-71
• 英文縮略詞71-72
• 附錄72-84
• 參考文獻(xiàn)80-84
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果84-85
• 致謝85-86

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Cheng-Ye Che;Cui Li;Ang Gao;Jing Lin;Li-Li Zhang;Qiang Xu;Qian Wang;Gui-Qiu Zhao;;Dectin-1 expression at early period of Aspergillus fumigatus infection in rat's corneal epithelium[J];International Journal of Ophthalmology(English Edition);2013年01期

  本文關(guān)鍵詞：Dectin-1重組腺病毒對(duì)侵襲性肺曲霉病免疫保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：446378