本文關(guān)鍵詞：2009-2010年云南省腸道病毒相關(guān)無菌性腦炎的分子流行學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：無菌性腦炎是由多種病毒引起的以腦膜刺激征等中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀為主的臨床疾病。據(jù)報(bào)道85%以上的腦炎病例是由腸道病毒引起。該病可以發(fā)生在任何年齡段的人群,但易感人群通常為15歲以下的兒童。其傳播途徑為糞-口和呼吸道途徑。近年來隨著研究的深入,腸道病毒引起的無菌性腦炎的報(bào)道逐年增多,呈世界性分布,在中國(guó)大陸的不同省市或地區(qū)也常有報(bào)道,已經(jīng)成為嚴(yán)重影響少年兒童衛(wèi)生健康的公共衛(wèi)生問題。云南省位于中國(guó)西南邊陲,氣候宜人,為腸道病毒的傳播流行提供了有利條件。本研究采集了云南省某兒童醫(yī)院524例無菌性腦炎患兒的臨床樣本,進(jìn)行病原學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、遺傳學(xué)分析,旨在為云南省在該領(lǐng)域的研究提供重要的病原學(xué)和遺傳學(xué)資料,完善引起無菌性腦炎的腸道病毒病原譜的構(gòu)成。首先,對(duì)腸道病毒的PCR引物進(jìn)行篩選。從國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中常用的引物中選出3組5對(duì)引物,以(Coxsackievirus A16, CVA16)、(Coxsackievirus B5, CVB5)和(Echovirus 20, E20)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,結(jié)果最優(yōu)引物組合為：適用于擴(kuò)增B群腸道病毒的為B-OS/B-OAS和B-IS/B-IAS,適用于擴(kuò)增腸道病毒A群為EntAF/EntARo和EntAF／Ent AFi。其次,對(duì)采集的524份臨床樣本按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行處理,然后采用分子生物學(xué)和BLAST比對(duì)等方法對(duì)其病原學(xué)分析及臨床資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果,腸道病毒占18.4%(97例),其中主要的血清型有E30(16.5%)、CVB5(23.5%)、E9(24.7%),另外還檢出CVA16、CVA9、CVB2、CVB3、CVB4、E4、E6、E15、E16、E18、E21、E33和E12等血清型。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果與感染腸道病毒之間無對(duì)應(yīng)關(guān)系。最后,對(duì)部分檢出腸道病毒的臨床樣本進(jìn)行病毒分離、全基因組測(cè)序及其遺傳特性的分析。經(jīng)鑒定A155/YN/CHN/2009為CVB4, A108/YN/CHN/2009和 A242/YN/CHN/2009為CVA9。A155/YN/CHN/2009與原型株J. V. B Benschoten在VP1和全基因組的核苷酸序列同源性分別為85.1%、83.3%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示A155/YN/CHN/2009與其他中國(guó)大陸流行株屬于同一基因型(genotype)。重組分析結(jié)果表明A155/YN/CHN/2009是一株重組病毒。A108/YN/CHN/2009和A242/YN/CHN/2009與原型株Griggs在VP1和全基因組的核苷酸序列同源性為分別為81.3%,81.0%和80.7%,81.1%。對(duì)CVA9的全長(zhǎng)VP1基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,本實(shí)驗(yàn)分離株與其他中國(guó)株屬于同一基因型。重組分析結(jié)果顯示,A108/YN/CHN/2009 和 A242/YN/CHN/2009也發(fā)生了重組。2009-2010年引起云南省無菌性腦炎的腸道病毒主要血清型為E30、CVB5和E9；CVB4分離株A155/YN/CHN/2009,CVA9分離株A108/YN/CHN/2009和A242/YN/CHN/2009發(fā)生重組。另外,篩選出最佳的腸道病毒引物。這為無菌性腦炎的預(yù)防和控制提供實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ),同時(shí)也為今后的相關(guān)的研究提供背景資料及方法。
【關(guān)鍵詞】：無菌性腦炎 腸道病毒 引物 血清型 同源性 重組分析
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.3
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 前言10-20
• 1. 無菌性腦炎概述10-11
• 2. 腸道病毒概述11-19
• 2.1 腸道病毒的結(jié)構(gòu)特征11-13
• 2.2 腸道病毒分類13-14
• 2.3 腸道病毒的致病性14-18
• 2.4 腸道病毒的檢測(cè)方法18-19
• 3. 立題分析19-20
• 3.1 立題目的19
• 3.2 立題意義19-20
• 第一章 引物的篩選：基于定型腸道病毒的VP1基因的不同巢式或半巢式PCR評(píng)價(jià)20-28
• 引言20
• 1 材料與方法20-23
• 1.1 病毒株和臨床樣品20-21
• 1.1.1 病毒株20
• 1.1.2 臨床樣品20-21
• 1.2 引物設(shè)計(jì)和合成21
• 1.3 病毒株感染性滴度檢測(cè)21-22
• 1.4 病毒RNA的提取22-23
• 1.4.1 糞便樣本處理22
• 1.4.2 提取病毒RNA22-23
• 1.5 巢式或半巢式PCR23
• 2 結(jié)果23-26
• 2.1 病毒株感染性滴度23-24
• 2.2 不同稀釋度病毒株巢式或半巢式PCR24-25
• 2.3 臨床樣品巢式或半巢式PCR25-26
• 3 討論26-27
• 4 小結(jié)27-28
• 第二章 病原學(xué)和臨床資料分析28-43
• 引言28
• 1 材料和方法28-30
• 1.1 研究對(duì)象28
• 1.2 臨床流行病學(xué)資料28
• 1.3 臨床樣本28-29
• 1.4 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)腸道病毒29
• 1.4.1 試劑29
• 1.4.2 主要儀器與耗材29
• 1.5 臨床樣本RNA的提取29-30
• 1.5.1 樣本處理29
• 1.5.2 引物29-30
• 1.5.3 測(cè)序確定基因型30
• 1.6 進(jìn)化樹的構(gòu)建30
• 2 結(jié)果與分析30-40
• 2.1 腸道病毒血清型分析30-31
• 2.2 E9、CVB5和E30的系統(tǒng)進(jìn)化分析31-36
• 2.3 E9、CVB5和E30核苷酸和氨基酸同源性分析36-37
• 2.4 臨床資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析37-40
• 2.4.1 人口學(xué)特征37-38
• 2.4.2 臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析38-40
• 3 討論40-42
• 4 小結(jié)42-43
• 第三章 CV-B4和CV-A9的全基因組分析43-62
• 引言43
• 1 材料和方法43-48
• 1.1 細(xì)胞株、試劑、耗材、儀器設(shè)備43-44
• 1.1.1 細(xì)胞株43
• 1.1.2 試劑43-44
• 1.1.3 耗材44
• 1.1.4 儀器設(shè)備44
• 1.2 病毒分離44-45
• 1.2.1 樣本處理44
• 1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)44
• 1.2.3 標(biāo)本接種44
• 1.2.4 結(jié)果觀察44-45
• 1.3 病毒RNA的提取、VP1 RT-PCR、測(cè)序和定型45-47
• 1.3.1 病毒RNA的提取45-46
• 1.3.2 RT-PCR46
• 1.3.3 測(cè)序46
• 1.3.4 引物46-47
• 1.3.5 定型47
• 1.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析和重組分析47
• 1.5 進(jìn)化分析中用到的核酸序列的GenBank登錄號(hào)(accession numbers)47-48
• 2 結(jié)果48-60
• (一) CV-B448-55
• 2.1 CV-B4基因型的確定48-49
• 2.2 A155分離株的全基因組分析49-50
• 2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析50-52
• 2.4 重組分析52-55
• (二) CV-A955-60
• 2.5 A108和A245在KMB17細(xì)胞株上出現(xiàn)病變55
• 2.6 A242和A108的全基因組分析55-56
• 2.7 系統(tǒng)進(jìn)化分析56-58
• 2.8 重組分析58-60
• 3 討論60-61
• 4 小結(jié)61-62
• 結(jié)論62-63
• 展望63-65
• 參考文獻(xiàn)65-68
• 縮略詞表68-69
• 致謝69-70
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷70-71

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