本文關(guān)鍵詞：AKT信號(hào)通路與HBV感染、復(fù)制和抗病毒治療的關(guān)系，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：全世界約有20億人曾感染過(guò)HBV,其中大部分都是短暫一過(guò)性的,但是全球還是有超過(guò)3.5億的人因?yàn)闆](méi)有足夠強(qiáng)的免疫反應(yīng)去清除HBV而得了慢乙肝,每年約有50-100萬(wàn)人死于HBV相關(guān)的肝硬化、肝功能代償不全,肝細(xì)胞肝癌等肝臟疾病。雖然病毒的復(fù)制是在宿主肝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行,但是病毒本身并不造成宿主肝細(xì)胞的破壞,肝細(xì)胞的損傷主要是由于病毒感染后所介導(dǎo)的機(jī)體天然性與獲得性免疫應(yīng)答反應(yīng)造成的。由免疫效應(yīng)細(xì)胞分泌釋放的干擾素(IFNs,包括alpha、beta及gamma亞類)即是機(jī)體最有效的天然抗病毒的一種機(jī)制。目前在臨床上應(yīng)用的人工合成的IFN(包括普通干擾素和長(zhǎng)效-干擾素)在接受治療的且能夠耐受的病人中,可以獲得30%～40%的轉(zhuǎn)陰率。然而,由于機(jī)體各種細(xì)胞膜上都有干擾素受體,因此IFN的副作用較大,絕大多數(shù)患者都不能耐受。臨床上另一類抗病毒藥物是核苷類似物(NAs,包括拉米夫定、阿德福韋、替米夫定、恩替卡韋和替諾夫韋),它主要是針對(duì)病毒的自我復(fù)制過(guò)程,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的抑制病毒DNA聚合酶、阻礙病毒DNA合成鏈的延伸,從而影響HBV DNA的復(fù)制。因?yàn)镹As是通過(guò)與內(nèi)源性的核苷酸競(jìng)爭(zhēng),因此NAs藥物的治療通常需要經(jīng)歷長(zhǎng)期甚至終身的治療過(guò)程,而且早期的NAs還很容易誘發(fā)病毒突變而導(dǎo)致耐藥和復(fù)發(fā),引起復(fù)發(fā)的主要原因就是由于其不能有效的清除病毒復(fù)制的模板HBV cccDNA。在病毒復(fù)制過(guò)程中,核苷酸作為病毒復(fù)制的原料扮演著重要的角色,而糖代謝的中間產(chǎn)物5-磷酸核糖就是核苷酸合成的原料,由此可知核苷酸的合成與病毒復(fù)制能否進(jìn)行也是受是機(jī)體糖代謝的調(diào)控的。在糖代謝調(diào)控中的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)控因子便是蛋白激酶B,又叫AKT,AKT能夠通過(guò)影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter, GLUTs)的表達(dá)和質(zhì)膜轉(zhuǎn)位以及對(duì)糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶活性與表達(dá)的調(diào)節(jié)而影響糖代謝的途徑和結(jié)局,尤其是與核苷酸生物合成關(guān)聯(lián)的磷酸戊糖旁路(Pentose Phosphate Pathway, PPP),后者是產(chǎn)生核苷酸生物合成代謝中間產(chǎn)物核糖—5—磷酸(R—5—P)的關(guān)鍵代謝通路。已有文獻(xiàn)報(bào)道AKT活性與HBV的體外復(fù)制成水平呈負(fù)相關(guān),顯然這樣的相關(guān)性與AKT在糖酵解和核苷酸代謝過(guò)程(R—5—P)中所起到的作用是矛盾的。為了進(jìn)一步理清AKT活性與HBV復(fù)制及抗病毒治療的關(guān)系,我們?cè)O(shè)計(jì)通過(guò)體外細(xì)胞水平、HBV攜帶小鼠動(dòng)物模型及臨床病人的組織樣本上來(lái)分別探討AKT活化與HBV感染、復(fù)制的關(guān)系。并通過(guò)AKT抑制劑的使用來(lái)觀察其抗病毒作用效果,以及AKT抑制劑與核苷類似物藥物的相互影響,以期望從病毒復(fù)制的源頭核苷酸的生物合成上阻斷病毒的復(fù)制,從而達(dá)到從感染肝細(xì)胞中徹底清除HBV的作用。結(jié)果：1、在肝細(xì)胞系L02、HepG2、HepG2.215、Bel、SMMC-7721中篩選AKT-S473表達(dá)情況的實(shí)驗(yàn)中,轉(zhuǎn)入HBV全基因的HepG2.215細(xì)胞AKT-S473的表達(dá)較其他細(xì)胞株多,而且裸鼠的HBV感染模型以及乙肝病人的肝組織中AKT-S473的表達(dá)與正常對(duì)照組相比均明顯提高。2、在轉(zhuǎn)入pEGFP-CA-AKT 和 pEGFP-NA-AKT質(zhì)粒的HepG2.215中,利用WB檢測(cè)到轉(zhuǎn)染pEGFP-CA-AKT質(zhì)粒能夠活化AKT,而轉(zhuǎn)染pEGFP-NA-AKT可有效抑制AKT的活化,ddPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后HepG2.215細(xì)胞上清中HBV DNA的量,結(jié)果顯示HBV DNA會(huì)隨著AKT的活化而增多,隨AKT的失活而減少。3、AKT抑制劑AZD5363在劑量濃度為1 μM時(shí)HepG2.215細(xì)胞中HBV DNA減少了52%,AKT抑制劑AKTil/2劑量達(dá)到0.5μM時(shí),HepG2.215細(xì)胞中HBV DNA減少了44%,當(dāng)雷帕霉素靶蛋白C1(mammalian target of rapamycin C1, mTORC1)抑制劑Rapamycin 劑量濃度達(dá)到1μM時(shí),HepG2.215細(xì)胞中HBV DNA減少了39%。ADZ5363 (1μM)、AKTi1/2 (0.5 μM)和Rapamycin (1 μM)、Tenofovir(O.15μM)聯(lián)合應(yīng)用后HepG2.215細(xì)胞上清中的HBV DNA量分別減少了88%、89%、62%。所以當(dāng)抑制劑與核苷類似物聯(lián)合應(yīng)用時(shí),其抗HBV的效果都要好于單獨(dú)使用。而且AKT及mTORC1抑制劑還能夠有效減少HepG2.215細(xì)胞中HBV基因的翻譯自前基因組RNA (pregenomic RNA, pgRNA)和 cccDNA,在予以藥物處理9天后,ADZ5363單獨(dú)使用組、ADZ5363與Tenofovir聯(lián)合用藥組、Rapamycin單獨(dú)使用組以及Rapamycin與 Tenofovir聯(lián)合用藥組HepG2.215細(xì)胞中的HBV pgRNA分別減少了61%、88%、77%、60%；并且藥物處理15天后HepG2.215細(xì)胞中cccDNA均下降了40%左右。在裸鼠HBV感染動(dòng)物模型中,也同樣證實(shí)AKT的抑制劑在體內(nèi)具有抗病毒的效果,在第三周時(shí)各治療組中鼠血液中的HBV DNA與加藥治療前相比ADZ5363與Tenofovir聯(lián)合用藥組、ADZ5363組與Tenofovir組HBV DNA分別降低了74%、72%和61%,并且在抑制劑治療一個(gè)月后,HBV表面抗原明顯降低。結(jié)論：1、HBV的感染能夠誘導(dǎo)AKT的活化。2、AKT的活化能夠促進(jìn)HBV的復(fù)制。3、AKT抑制劑可以抑制HBV的復(fù)制,具有較好的抗病毒效果,與抗病毒藥物聯(lián)用時(shí)抗病毒效果好于單獨(dú)使用。AKT還抑制劑可以抑制HBV RNA的轉(zhuǎn)錄從而有利于減少HBV cccDNA與HBV DN A復(fù)制的模板。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒 AKT AKT抑制劑 cccDNA 抗病毒治療
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.62
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-19
• 第一章：ddPCR用于HBV DNA檢測(cè)方法學(xué)的建立19-33
• 引言19
• 1 材料與方法19-23
• 1.1 材料19-21
• 1.2 方法21-23
• 2 結(jié)果23-31
• 2.1 數(shù)字PCR的精確性和敏感度檢驗(yàn)23-25
• 2.2 針對(duì)HBV DNA以及HBV cccDNA進(jìn)行ddPCR檢測(cè)的引物設(shè)計(jì)及樣本處理25-28
• 2.3 qRT-PCR與ddPCR檢測(cè)HBV DNA和HBV cccDNA的比較28-31
• 3 討論31-33
• 第二章：HBV感染與AKT信號(hào)通路的活化33-44
• 引言33
• 1 材料與方法33-38
• 1.1 材料33-35
• 1.2 方法35-38
• 2 結(jié)果38-42
• 2.1 HBV感染與AKT活化的關(guān)系38-39
• 2.2 肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HBV質(zhì)粒驗(yàn)證AKT的活化與HBV有關(guān)39-40
• 2.3 建立鼠慢乙肝模型并體內(nèi)驗(yàn)證HBV感染能夠使AKT活化40-41
• 2.4 臨床病人HBV病毒載量與AKT酸化41-42
• 3 討論42-44
• 第三章：AKT活性對(duì)HBV病毒復(fù)制的影響44-52
• 引言44
• 1 材料與方法44-49
• 1.1 材料44-46
• 1.2 方法46-49
• 2 結(jié)果49-51
• 3 討論51-52
• 第四章：AKT抑制劑抗HBV效果52-68
• 引言52
• 1 材料與方法52-58
• 1.1 材料52-54
• 1.2 方法54-58
• 2 結(jié)果58-66
• 2.1 AKT與mTORC1抑制劑的體外抗HBV效果58-64
• 2.2 AKT抑制劑及HBV抗病毒治療藥物的體內(nèi)治療效果64-66
• 3 討論66-68
• 全文總結(jié)68-69
• 參考文獻(xiàn)69-73
• 文獻(xiàn)綜述73-81
• 參考文獻(xiàn)78-81
• 致謝81-82
• 在讀期間發(fā)表論文及申請(qǐng)專利項(xiàng)目82

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