本文關(guān)鍵詞：AKT信號通路與HBV感染、復(fù)制和抗病毒治療的關(guān)系，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：全世界約有20億人曾感染過HBV,其中大部分都是短暫一過性的,但是全球還是有超過3.5億的人因為沒有足夠強的免疫反應(yīng)去清除HBV而得了慢乙肝,每年約有50-100萬人死于HBV相關(guān)的肝硬化、肝功能代償不全,肝細胞肝癌等肝臟疾病。雖然病毒的復(fù)制是在宿主肝細胞內(nèi)進行,但是病毒本身并不造成宿主肝細胞的破壞,肝細胞的損傷主要是由于病毒感染后所介導(dǎo)的機體天然性與獲得性免疫應(yīng)答反應(yīng)造成的。由免疫效應(yīng)細胞分泌釋放的干擾素(IFNs,包括alpha、beta及gamma亞類)即是機體最有效的天然抗病毒的一種機制。目前在臨床上應(yīng)用的人工合成的IFN(包括普通干擾素和長效-干擾素)在接受治療的且能夠耐受的病人中,可以獲得30%～40%的轉(zhuǎn)陰率。然而,由于機體各種細胞膜上都有干擾素受體,因此IFN的副作用較大,絕大多數(shù)患者都不能耐受。臨床上另一類抗病毒藥物是核苷類似物(NAs,包括拉米夫定、阿德福韋、替米夫定、恩替卡韋和替諾夫韋),它主要是針對病毒的自我復(fù)制過程,通過競爭性的抑制病毒DNA聚合酶、阻礙病毒DNA合成鏈的延伸,從而影響HBV DNA的復(fù)制。因為NAs是通過與內(nèi)源性的核苷酸競爭,因此NAs藥物的治療通常需要經(jīng)歷長期甚至終身的治療過程,而且早期的NAs還很容易誘發(fā)病毒突變而導(dǎo)致耐藥和復(fù)發(fā),引起復(fù)發(fā)的主要原因就是由于其不能有效的清除病毒復(fù)制的模板HBV cccDNA。在病毒復(fù)制過程中,核苷酸作為病毒復(fù)制的原料扮演著重要的角色,而糖代謝的中間產(chǎn)物5-磷酸核糖就是核苷酸合成的原料,由此可知核苷酸的合成與病毒復(fù)制能否進行也是受是機體糖代謝的調(diào)控的。在糖代謝調(diào)控中的一個關(guān)鍵的調(diào)控因子便是蛋白激酶B,又叫AKT,AKT能夠通過影響葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucose transporter, GLUTs)的表達和質(zhì)膜轉(zhuǎn)位以及對糖酵解過程中的關(guān)鍵限速酶活性與表達的調(diào)節(jié)而影響糖代謝的途徑和結(jié)局,尤其是與核苷酸生物合成關(guān)聯(lián)的磷酸戊糖旁路(Pentose Phosphate Pathway, PPP),后者是產(chǎn)生核苷酸生物合成代謝中間產(chǎn)物核糖—5—磷酸(R—5—P)的關(guān)鍵代謝通路。已有文獻報道AKT活性與HBV的體外復(fù)制成水平呈負相關(guān),顯然這樣的相關(guān)性與AKT在糖酵解和核苷酸代謝過程(R—5—P)中所起到的作用是矛盾的。為了進一步理清AKT活性與HBV復(fù)制及抗病毒治療的關(guān)系,我們設(shè)計通過體外細胞水平、HBV攜帶小鼠動物模型及臨床病人的組織樣本上來分別探討AKT活化與HBV感染、復(fù)制的關(guān)系。并通過AKT抑制劑的使用來觀察其抗病毒作用效果,以及AKT抑制劑與核苷類似物藥物的相互影響,以期望從病毒復(fù)制的源頭核苷酸的生物合成上阻斷病毒的復(fù)制,從而達到從感染肝細胞中徹底清除HBV的作用。結(jié)果：1、在肝細胞系L02、HepG2、HepG2.215、Bel、SMMC-7721中篩選AKT-S473表達情況的實驗中,轉(zhuǎn)入HBV全基因的HepG2.215細胞AKT-S473的表達較其他細胞株多,而且裸鼠的HBV感染模型以及乙肝病人的肝組織中AKT-S473的表達與正常對照組相比均明顯提高。2、在轉(zhuǎn)入pEGFP-CA-AKT 和 pEGFP-NA-AKT質(zhì)粒的HepG2.215中,利用WB檢測到轉(zhuǎn)染pEGFP-CA-AKT質(zhì)粒能夠活化AKT,而轉(zhuǎn)染pEGFP-NA-AKT可有效抑制AKT的活化,ddPCR檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后HepG2.215細胞上清中HBV DNA的量,結(jié)果顯示HBV DNA會隨著AKT的活化而增多,隨AKT的失活而減少。3、AKT抑制劑AZD5363在劑量濃度為1 μM時HepG2.215細胞中HBV DNA減少了52%,AKT抑制劑AKTil/2劑量達到0.5μM時,HepG2.215細胞中HBV DNA減少了44%,當(dāng)雷帕霉素靶蛋白C1(mammalian target of rapamycin C1, mTORC1)抑制劑Rapamycin 劑量濃度達到1μM時,HepG2.215細胞中HBV DNA減少了39%。ADZ5363 (1μM)、AKTi1/2 (0.5 μM)和Rapamycin (1 μM)、Tenofovir(O.15μM)聯(lián)合應(yīng)用后HepG2.215細胞上清中的HBV DNA量分別減少了88%、89%、62%。所以當(dāng)抑制劑與核苷類似物聯(lián)合應(yīng)用時,其抗HBV的效果都要好于單獨使用。而且AKT及mTORC1抑制劑還能夠有效減少HepG2.215細胞中HBV基因的翻譯自前基因組RNA (pregenomic RNA, pgRNA)和 cccDNA,在予以藥物處理9天后,ADZ5363單獨使用組、ADZ5363與Tenofovir聯(lián)合用藥組、Rapamycin單獨使用組以及Rapamycin與 Tenofovir聯(lián)合用藥組HepG2.215細胞中的HBV pgRNA分別減少了61%、88%、77%、60%；并且藥物處理15天后HepG2.215細胞中cccDNA均下降了40%左右。在裸鼠HBV感染動物模型中,也同樣證實AKT的抑制劑在體內(nèi)具有抗病毒的效果,在第三周時各治療組中鼠血液中的HBV DNA與加藥治療前相比ADZ5363與Tenofovir聯(lián)合用藥組、ADZ5363組與Tenofovir組HBV DNA分別降低了74%、72%和61%,并且在抑制劑治療一個月后,HBV表面抗原明顯降低。結(jié)論：1、HBV的感染能夠誘導(dǎo)AKT的活化。2、AKT的活化能夠促進HBV的復(fù)制。3、AKT抑制劑可以抑制HBV的復(fù)制,具有較好的抗病毒效果,與抗病毒藥物聯(lián)用時抗病毒效果好于單獨使用。AKT還抑制劑可以抑制HBV RNA的轉(zhuǎn)錄從而有利于減少HBV cccDNA與HBV DN A復(fù)制的模板。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒 AKT AKT抑制劑 cccDNA 抗病毒治療
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.62
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-16
• 前言16-19
• 第一章：ddPCR用于HBV DNA檢測方法學(xué)的建立19-33
• 引言19
• 1 材料與方法19-23
• 1.1 材料19-21
• 1.2 方法21-23
• 2 結(jié)果23-31
• 2.1 數(shù)字PCR的精確性和敏感度檢驗23-25
• 2.2 針對HBV DNA以及HBV cccDNA進行ddPCR檢測的引物設(shè)計及樣本處理25-28
• 2.3 qRT-PCR與ddPCR檢測HBV DNA和HBV cccDNA的比較28-31
• 3 討論31-33
• 第二章：HBV感染與AKT信號通路的活化33-44
• 引言33
• 1 材料與方法33-38
• 1.1 材料33-35
• 1.2 方法35-38
• 2 結(jié)果38-42
• 2.1 HBV感染與AKT活化的關(guān)系38-39
• 2.2 肝癌細胞中轉(zhuǎn)染HBV質(zhì)粒驗證AKT的活化與HBV有關(guān)39-40
• 2.3 建立鼠慢乙肝模型并體內(nèi)驗證HBV感染能夠使AKT活化40-41
• 2.4 臨床病人HBV病毒載量與AKT酸化41-42
• 3 討論42-44
• 第三章：AKT活性對HBV病毒復(fù)制的影響44-52
• 引言44
• 1 材料與方法44-49
• 1.1 材料44-46
• 1.2 方法46-49
• 2 結(jié)果49-51
• 3 討論51-52
• 第四章：AKT抑制劑抗HBV效果52-68
• 引言52
• 1 材料與方法52-58
• 1.1 材料52-54
• 1.2 方法54-58
• 2 結(jié)果58-66
• 2.1 AKT與mTORC1抑制劑的體外抗HBV效果58-64
• 2.2 AKT抑制劑及HBV抗病毒治療藥物的體內(nèi)治療效果64-66
• 3 討論66-68
• 全文總結(jié)68-69
• 參考文獻69-73
• 文獻綜述73-81
• 參考文獻78-81
• 致謝81-82
• 在讀期間發(fā)表論文及申請專利項目82

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1 陳嵬;;Analysis of related factors for intrahepatic HBV cccDNA level in patients with chronic HBV infection[J];China Medical Abstracts(Internal Medicine);2013年03期

2 趙克開,繆曉輝;乙型肝炎病毒cccDNA檢測的方法與臨床意義[J];中華肝臟病雜志;2005年04期

3 楊培;秦波;;HBV cccDNA檢測方法及其研究意義[J];世界華人消化雜志;2006年20期

4 李軍;宋培新;韓亞萍;劉婷;黃祖瑚;;慢性HBV感染者肝組織HBV cccDNA的定量檢測[J];中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2007年06期

5 陳從新;;HBV cccDNA的檢測及其意義[J];實用肝臟病雜志;2007年05期

6 陸暉;江建寧;;HBV cccDNA檢測的研究進展[J];內(nèi)科;2008年02期

7 張雪娟;李全榮;;cccDNA的最新研究進展[J];臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志;2008年07期

8 羅進;郭晏海;;熒光PCR檢測乙型肝炎病毒cccDNA方法的建立[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2008年07期

9 李紅;唐紅;;乙肝病毒cccDNA檢測方法及臨床意義的研究進展[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2009年03期

10 陳偉;劉群英;張曉峰;鄧超;包菊平;;血清中乙肝病毒全長cccDNA的檢測及其臨床意義[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2010年01期

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1 許鍇;鄭加永;柳牡丹;;外周血HBV cccDNA檢測的臨床價值[A];2009年浙江省檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2009年

2 戴二黑;李兵順;侯軍良;何朝霞;任桂芳;王蔚;劉云燕;;血清HBV cccDNA檢測方法的建立與臨床應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中華醫(yī)學(xué)會檢驗分會成立30周年慶典大會資料匯編[C];2009年

3 侯軍良;劉玉珍;戴二黑;李兵順;;血清HBV cccDNA檢測方法的建立與臨床應(yīng)用[A];第五屆全國中醫(yī)藥免疫學(xué)術(shù)研討會——暨環(huán)境·免疫與腫瘤防治綜合交叉會議論文匯編[C];2009年

4 李軍;宋培新;韓亞萍;黃祖瑚;;慢性HBV感染者肝組織HBV cccDNA的定量檢測[A];中華醫(yī)學(xué)會全國第九次感染病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

5 陳保德;陳瑜;;HBV cccDNA檢測技術(shù)及研究進展[A];2007年浙江省醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2007年

6 陳保德;陳瑜;;HBV cccDNA檢測技術(shù)及研究進展[A];2008年浙江省檢驗醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2008年

7 鐘彥偉;胡雙燁;徐晨;趙雨來;李智彬;朱世殊;張鴻飛;董漪;;一種新的原位檢測肝組織HBV cccDNA的方法[A];第7屆全國疑難及重癥肝病大會論文集[C];2013年

8 鐘彥偉;胡雙燁;徐晨;趙雨來;李志彬;朱世殊;張鴻飛;董漪;;一種新的原位檢測肝組織HBV cccDNA的方法[A];中華醫(yī)學(xué)會第十六次全國病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2013年

9 繆曉輝;趙克開;;乙肝病毒cccDNA檢測方法與臨床意義[A];中華醫(yī)學(xué)會第十二次全國病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

10 郝勇;繆曉輝;趙克開;李東良;苗千里;林江;沈雪林;;慢性乙型肝炎患者外周血單個核細胞及肝組織中HBV cccDNA定量檢測[A];中華醫(yī)學(xué)會全國第九次感染病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

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1 劉士敬;判斷乙肝病情和療效檢測HBV cccDNA[N];健康報;2005年

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1 張詠梅;乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA（HBV cccDNA）的甲基化及其調(diào)控HBV復(fù)制和基因表達的作用研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 郝勇;HBV cccDNA特異性定量檢測方法篩選優(yōu)化及應(yīng)用研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

3 劉飛;抗HBV藥物的分子藥效學(xué)評價模型以及減少HBV耐藥的策略研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

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5 邵俊斌;乙型肝炎病毒細胞核轉(zhuǎn)位動態(tài)監(jiān)測及HBV cccDNA熒光定量PCR分析研究[D];浙江大學(xué);2004年

6 趙克開;血清中嗜肝DNA病毒共價閉合環(huán)狀DNA動態(tài)檢測的實驗和臨床研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2007年

7 阮鵬;乙肝患者肝內(nèi)cccDNA水平、HBV整合狀況及其臨床意義研究[D];武漢大學(xué);2014年

8 蒲春文;優(yōu)化選擇的串聯(lián)序列amiRNA表達載體抗乙肝病毒的研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2011年

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1 牟迪;AKT信號通路與HBV感染、復(fù)制和抗病毒治療的關(guān)系[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

2 羅璇;HBV感染引起的肝癌中HBV cccDNA與AP0BEC3的相關(guān)性研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

3 陳勇;實時熒光定量PCR檢測HBV cccDNA體系建立及臨床應(yīng)用初步研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2008年

4 李瑩;HBV cccDNA定量檢測方法的建立及臨床初步應(yīng)用[D];天津醫(yī)科大學(xué);2009年

5 張新枝;慢性乙型肝炎病毒感染者血清HBV cccDNA檢測的臨床意義[D];暨南大學(xué);2006年

6 楊培;HBV cccDNA熒光定量PCR檢測體系建立及初步應(yīng)用研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2007年

7 李忠斌;慢性乙型肝炎耐藥患者外周血單個核細胞HBV cccDNA耐藥相關(guān)基因突變特點研究[D];中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2012年

8 宋培新;慢性HBV感染者肝組織中HBV cccDNA定量檢測方法的建立[D];南京醫(yī)科大學(xué);2006年

9 王甜;HBV cccDNA的檢測方法及其在慢性乙型肝炎臨床應(yīng)用中的研究進展[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2014年

10 馬艷麗;慢性乙型肝炎肝內(nèi)cccDNA定量測定的臨床意義研究[D];山東大學(xué);2006年

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