結(jié)核病是迄今為止全世界最難控制的傳染性疾病之一,近年來耐藥結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病發(fā)病率的不斷上升使得結(jié)核病疫情再度嚴峻。由于現(xiàn)有的抗結(jié)核治療方案還遠遠不夠理想,亟需加速新型抗結(jié)核藥物的研究開發(fā)。肽脫甲酰基酶(PDF)是一種細菌必需的金屬酶,在蛋白質(zhì)合成中起到從甲硫氨酸殘基脫掉N端甲�；淖饔�。PDF是細菌蛋白質(zhì)合成必需的一個酶,但在真核細胞的蛋白質(zhì)合成中卻并不是必要的,因此,PDF成為新型抗菌藥物篩選的靶點之一。微生物次級代謝產(chǎn)物是研制新藥的重要資源之一,微生物的多樣性及其代謝產(chǎn)物的多樣性和新穎性使微生物藥物在醫(yī)藥方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本課題組利用前期建立的PDF為靶點的抗結(jié)核藥物高通量篩選模型對中國藥學(xué)微生物菌種保藏管理中心豐富的微生物發(fā)酵液樣品庫進行篩選,發(fā)現(xiàn)鏈霉菌CPCC 203702發(fā)酵液同時具有抗結(jié)核分枝桿菌和PDF酶抑制活性。本研究對鏈霉菌CPCC 203702進行放大發(fā)酵,以抗恥垢分枝桿菌活性和PDF抑制活性為導(dǎo)向,采取常規(guī)的分離純化流程,包括硅膠柱層析、Sephadex LH-20柱層析、半制備HPLC等多種分離方法進行分離純化,從發(fā)酵液中分離得到1...

【文章頁數(shù)】：88 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略語一覽表
前言
實驗材料
    1. 菌株
    2. 主要培養(yǎng)基
        2.1 檢定培養(yǎng)基
        2.2 斜面培養(yǎng)基
        2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基
    3. 主要試劑
    4. 主要儀器
    5. 相關(guān)溶液的配制
        5.1 SDS-PAGE相關(guān)溶液
        5.2 蛋白純化相關(guān)溶液
        5.3 酶活性檢測相關(guān)溶液
        5.4 其他溶液
實驗方法
    一.鏈霉菌CPCC 203702發(fā)酵條件摸索及放大發(fā)酵
        1. 斜面培養(yǎng)基的確定
        2. 發(fā)酵時間的確定
        3. 鏈霉菌CPCC 203702放大發(fā)酵
    二.抗恥垢分枝桿菌活性導(dǎo)向的次級代謝產(chǎn)物的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定
        1. 活性次級代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)
            1.1 發(fā)酵液初步處理
            1.2 活性導(dǎo)向的分離純化過程
            1.3 化合物結(jié)構(gòu)解析
            1.4 化合物活性初步評價
        2. Berninamycin類抗生素新組分的發(fā)現(xiàn)與鑒定
            2.1 分離純化過程
            2.2 化合物結(jié)構(gòu)解析
            2.3 化合物活性初步評價
    三. 抑制結(jié)核分枝桿菌PDF活性導(dǎo)向的次級代謝產(chǎn)物分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定
        1. 目的蛋白的純化
            1.1 樣品處理
            1.2 使用AKTA explorer系統(tǒng)純化蛋白
            1.3 蛋白脫鹽、脫咪唑及濃縮
            1.4 SDS-PAGE電泳檢測
            1.5 蛋白濃度測定
        2. 酶活性檢測
            2.1 蛋白活性測定原理
            2.2 酶活性測定步驟
            2.3 酶抑制率計算公式
        3. 活性次級代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)
            3.1 活性導(dǎo)向的分離純化過程
            3.2 化合物活性測定
    四. 其他化合物的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定
        1. 上清液乙酸乙酯部分
        2. 菌絲體甲醇抽提物乙酸乙酯部分
實驗結(jié)果與分析
    一. 鏈霉菌CPCC 203702發(fā)酵條件摸索及放大發(fā)酵
        1. 斜面培養(yǎng)基的確定
        2. 發(fā)酵時間的確定
        3. 鏈霉菌CPCC 203702的放大發(fā)酵
    二. 抗恥垢分枝桿菌活性導(dǎo)向的代謝產(chǎn)物的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定
        1. 活性次級代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)
            1.1 發(fā)酵液初步處理及活性結(jié)果
            1.2 活性導(dǎo)向的分離純化過程
            1.3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定
            1.4 化合物活性初步評價
        2. Berninamycin類抗生素新組分的發(fā)現(xiàn)與鑒定
            2.1 化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的分離純化過程
            2.2 化合物結(jié)構(gòu)解析
            2.3 化合物活性的初步評價
    三. 抑制結(jié)核分枝桿菌PDF活性導(dǎo)向的次級代謝產(chǎn)物的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定
        1. 結(jié)核分枝桿菌PDF酶的表達與純化
        2. 活性導(dǎo)向的分離純化過程
        3. 化合物活性初步測定和結(jié)構(gòu)解析
    四.其他類型化合物的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定
        1. 其他類型化合物的分離及化合物結(jié)構(gòu)式
        2. 化合物結(jié)構(gòu)鑒定
五.討論
結(jié)論
參考文獻
附圖
致謝



本文編號：3821083