狂犬病嚴(yán)重影響公共健康,2015年約17,400人死于狂犬病。近年來,細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在狂犬病疫苗和其它病毒疫苗生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用。人二倍體細(xì)胞（HDCs）和Vero細(xì)胞是目前用于狂犬病疫苗生產(chǎn)的常用細(xì)胞株。與神經(jīng)組織疫苗、禽胚組織疫苗、原代地鼠腎細(xì)胞疫苗、及雞胚細(xì)胞疫苗相比,HDC和Vero細(xì)胞培養(yǎng)的狂犬病疫苗具有更高的安全性。早在1974年,人們通過復(fù)雜的馴化和感染條件優(yōu)化,建立了基于人二倍體細(xì)胞MRC-5細(xì)胞的狂犬疫苗生產(chǎn)工藝。由于MRC-5對(duì)狂犬病毒（RABV）不敏感、擴(kuò)增周期長(zhǎng)、培養(yǎng)程序復(fù)雜,且疫苗產(chǎn)率低等不足導(dǎo)致了MRC-5狂犬疫苗的生產(chǎn)成本高。這限制了該類疫苗在狂犬病高發(fā)的發(fā)展中國(guó)家的推廣使用。Vero細(xì)胞是一永生化的非洲綠猴腎細(xì)胞株,該細(xì)胞系缺乏I型干擾素（IFN-I）信號(hào)通路,是RABV敏感細(xì)胞株。1985年,基于Vero細(xì)胞生產(chǎn)的狂犬疫苗首次用于接種。本論文擬通過研究RABV與宿主細(xì)胞（MRC-5細(xì)胞和Vero細(xì)胞）相互作用機(jī)制,揭示MRC-5細(xì)胞抵抗RABV感染而Vero細(xì)胞對(duì)RABV感染敏感的詳細(xì)機(jī)制,為基于MRC-5細(xì)胞的狂犬疫苗生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。外... 

【文章頁(yè)數(shù)】：109 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
abstract
縮略詞表
第一章 前言
    1.1 外泌體及其研究進(jìn)展
        1.1.1 外泌體
        1.1.2 外泌體在病毒感染中的功能及機(jī)理研究
        1.1.3 基于外泌體的疾病診斷標(biāo)志物,藥物或生物分子傳輸載體構(gòu)建及應(yīng)用
    1.2 狂犬病毒及基于細(xì)胞培養(yǎng)的狂犬疫苗現(xiàn)狀
        1.2.1 狂犬病毒
        1.2.2 狂犬疫苗的現(xiàn)狀
        1.2.3 IFN與狂犬病毒感染的機(jī)制
    1.3 micro RNA在病毒感染過程中的功能及機(jī)理
        1.3.1 microRNA生物功能
        1.3.2 microRNA在病毒感染過程中的功能及機(jī)理
    1.4 立題依據(jù)和創(chuàng)新點(diǎn)
        1.4.1 立題依據(jù)
        1.4.2 創(chuàng)新點(diǎn)
第二章 外泌體分離方法的建立
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 細(xì)胞和病毒
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 常規(guī)試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        2.2.2 狂犬病毒擴(kuò)增及滴度的測(cè)定
        2.2.3 RABV感染細(xì)胞
        2.2.4 OptiPrepTM密度梯度分離純化RABV感染Vero細(xì)胞上清液的外泌體
        2.2.5 超速離心分離純化RABV感染MRC-5 細(xì)胞上清液的外泌體
        2.2.6 乙酰膽堿酯酶(AChE)活力的測(cè)定
        2.2.7 狂犬病毒G蛋白酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)
        2.2.8 蛋白免疫印記法(Western Blot)驗(yàn)證外泌體標(biāo)志性蛋白
        2.2.9 透射電鏡(Transmission electron microscope,TEM)
        2.2.10 統(tǒng)計(jì)分析
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 OptiPrep~(TM)密度梯度分離純化RABV感染Vero細(xì)胞上清中的外泌體
        2.3.2 超速離心法分離純化RABV感染MRC-5 細(xì)胞上清液中外泌體
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第三章 外泌體能攜帶miR-423-5p抑制狂犬病毒在MRC-5細(xì)胞中的復(fù)制
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 主要儀器
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 引物設(shè)計(jì)
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 RABV感染MRC-5 細(xì)胞
        3.2.2 外泌體的制備與表征
        3.2.3 納米顆粒追蹤分析儀(Nanoparticle tracking analysis,NTA)定量外泌體含量
        3.2.4 DiO染料標(biāo)記外泌體
        3.2.5 DiO-Exo攝取試驗(yàn)
        3.2.6 細(xì)胞和外泌體總RNA提取
        3.2.7 外泌體小RNA(small RNA)二代測(cè)序及生物信息學(xué)分析
        3.2.8 siRNA、miRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞試驗(yàn)
        3.2.9 實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)
        3.2.10 雙熒光素報(bào)告基因的檢測(cè)
        3.2.11 免疫熒光共聚焦
        3.2.12 統(tǒng)計(jì)分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 RABV對(duì) MRC-5 細(xì)胞低敏感性
        3.3.2 RABV感染增加宿主細(xì)胞外泌體分泌量
        3.3.3 抑制外泌體釋放能促進(jìn)RABV在 MRC-5 細(xì)胞的感染
        3.3.4 RABV感染能夠改變外泌體miRNA表達(dá)譜
        3.3.5 miR-423-5p靶向SOCS3 基因
        3.3.6 miR-423-5p提高M(jìn)RC-5 細(xì)胞抵抗RABV感染
        3.3.7 外泌體miR-423-5p抑制RABV感染MRC-5 細(xì)胞
        3.3.8 miR-423-5p對(duì) IFN-I信號(hào)通路的作用
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 外泌體促進(jìn)狂犬病毒對(duì)Vero細(xì)胞的感染
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 細(xì)胞株和病毒
        4.1.2 主要儀器
        4.1.3 主要試劑
        4.1.4 常規(guī)試劑
        4.1.5 引物設(shè)計(jì)
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 狂犬病毒感染Vero細(xì)胞
        4.2.2 超薄細(xì)胞切片及TEM觀察
        4.2.3 NTA定量外泌體含量
        4.2.4 外泌體的制備及表征和鑒定
        4.2.5 外泌體抑制劑對(duì)病毒復(fù)制影響試驗(yàn)
        4.2.6 病毒總RNA提取和實(shí)時(shí)定量PCR
        4.2.7 統(tǒng)計(jì)分析
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 TEM觀察病毒感染細(xì)胞釋放外泌體
        4.3.2 病毒感染誘導(dǎo)外泌體釋放
        4.3.3 GW4869 抑制外泌體釋放,降低病毒感染
        4.3.4 si-Rab27a抑制外泌體釋放,降低病毒感染
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介及攻讀博士期間發(fā)表的文章
致謝



本文編號(hào)：3721219