發(fā)布時(shí)間：2022-05-03 00:04

　　目的設(shè)計(jì)并建立一種新的能夠同時(shí)測(cè)定核酸提取物中乙型肝炎病毒（HBV）前基因組RNA（pgRNA）和DNA的檢測(cè)方法。方法建立檢測(cè)HBV pgRNA和DNA的探針法雙重?zé)晒舛縋CR體系,通過DNA凝膠電泳、定量PCR等實(shí)驗(yàn)考察該檢測(cè)體系的特異性和靈敏度,驗(yàn)證以該方法測(cè)定HepG2.2.15細(xì)胞及其培養(yǎng)上清中HBV pgRNA和DNA的可行性及準(zhǔn)確度。結(jié)果建立的探針法雙重?zé)晒舛縋CR體系具有較好的特異性和靈敏度,測(cè)定不同稀釋倍數(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)上清時(shí),在稀釋倍數(shù)和測(cè)定結(jié)果間具有較好的相關(guān)性。但該方法更適用于測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBV pgRNA和DNA,而不適用于測(cè)定細(xì)胞樣本。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)建立的方法能夠避免核酸提取物中由于HBV DNA污染造成HBV RNA定量不準(zhǔn)的問題,并且在一管PCR反應(yīng)中同時(shí)實(shí)現(xiàn)了HBV pgRNA和DNA的雙重檢測(cè),極大提高了檢測(cè)效率,具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。 

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

PCR產(chǎn)物的DNA凝膠電泳圖

為保證本檢測(cè)方法的通用性,從HBV database網(wǎng)站上下載了8條不同的HBV全基因組序列(HBV基因型A、B、C、D各2條),對(duì)比其共有保守序列設(shè)計(jì)引物和探針。本方法檢測(cè)的是包括rcDNA和cccDNA在內(nèi)的總HBV DNA,rcDNA相較于cccDNA在正鏈有部分缺失,因此避開rcDNA正鏈缺失部分,選擇rcDNA和cccDNA共有的雙鏈部分設(shè)計(jì)上、下游引物和探針,分別命名為AF、AR、PA,PCR產(chǎn)物seq A長度為173 bp,定位于HBV基因組的S區(qū);HBV RNA包括0.7、2.1、2.4、3.5 kb 4種不同長度的5種RNA(圖 1)[10-11]。為了特異性檢測(cè)pgRNA,避免其他RNA的干擾,在pgRNA 5"端1 kb內(nèi)的區(qū)間設(shè)計(jì)上、下游引物和探針(這段區(qū)間內(nèi)的序列只有3.5 kb全長的轉(zhuǎn)錄本才有,其他較短的RNA轉(zhuǎn)錄本缺失此段序列,因此可以實(shí)現(xiàn)pgRNA的特異性檢測(cè)),分別命名為BF、BR、PB,PCR產(chǎn)物seq B長度為118 bp,定位于HBV基因組的C區(qū)。引物、探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物探針組A的上游引物AF(方向5"-3",下同)序列為GTG GTG GAC TTC TCT CAA TTT TCT AG,下游引物AR序列為TGA GGC ATA GCA GCA GGA TG,探針PA和修飾基團(tuán)序列為FAM-ACG CCG CAG ACA CAT-MGB;引物探針組B的上游引物BF序列為CCC TAT CTT ATC AAC ACT TCC GGA,下游引物BR序列為AGA TCT TCT GCG ACG CGG,探針PB和修飾基團(tuán)序列為Texas Red-CGT CTG CGA GGC GAG-MGB。1.2 細(xì)胞系及其培養(yǎng)方法

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]慢性乙型肝炎抗病毒治療相關(guān)新型標(biāo)志物及其臨床應(yīng)用[J]. 魯鳳民,曾婉嘉,文夏杰,廖昊,鄒軍,王雷婕,席婧媛,王建文,王杰,陳香梅.  肝臟. 2019(05)
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本文編號(hào)：3650227