戊型肝炎是由戊肝病毒（Hepatitis E virus,HEV）引起的一種傳染性疾病,目前發(fā)病率已超過甲肝,是我國急性肝炎的主要類型。HEV基因組全長序列含有3個開放蛋白編碼框（ORF1³）,其中ORF2基因編碼HEV的主要結構蛋白。ORF2蛋白免疫原性強且包含中和表位集中區(qū)域。目前已有基于HEV ORF2蛋白研發(fā)的HEV抗原檢測試劑盒應用于臨床診斷及治療監(jiān)測中,但對于農村地區(qū)和城鎮(zhèn)社區(qū)基層醫(yī)療單位,需要更快速、便捷的HEV抗原檢測方法。本研究前期制備出多株抗HEV ORF2單克隆抗體,通過間接ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay）實驗對單抗進行型別分析,比較單抗間親和力差異,篩選出與抗原結合能力強、具有廣譜性的單克隆抗體;利用免疫印跡法（Western blot,WB）和競爭抑制ELISA實驗對單克隆抗體識別ORF2抗原的空間位點及空間位置特征進行分析,在此基礎上利用HEV疫苗免疫后兔血清和自然感染者血清分析抗體優(yōu)勢表位,為HEV診斷、疫苗及感染機制的研究提供了理論基礎。將上述優(yōu)勢抗體進行組合,采用雙抗體夾心法研制HE... 

【文章來源】：河北大學河北省

【文章頁數】：68 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

HEV感染機體后HEV標志物的動態(tài)變化[13]

河北大學醫(yī)學碩士學位論文8構生物學的方法來進行精確定位的。8C11通過用晶體培養(yǎng)及X射線衍射的方法，成功獲得了8C11單抗Fab段和基因IV型HEVE2s蛋白（HEVORF2段，455-602aa）的晶體結構，進而研究出8C11位于Asp496~Thr499、Val510~Leu514和Asn573~Arg5783個非連續(xù)區(qū)，表明Glu479、Ser97、Arg512、His577、Arg57和Lys534是8C11的結合位點，參與抗原抗體相互作用最為關鍵的氨基酸是Arg512[49,50]。8G12單抗也通過與8C11單抗相同的分析方法，識別出8G12識別識別HEV構象型表位主要基于E549、K554和G591三個結合位點上[51]，具體如圖1-2[50,51]所示：（a）圖中E2s、8C11Fab重鏈和8C11Fab輕鏈分別用綠色、紫色和黃色表示；重鏈、輕鏈分別用VH和CH、VL和CL表示；（b）圖中E2S側面，8C11重鏈和輕鏈與E2S相互作用表位殘基分別以紫色和黃色表示，Arg512在與兩條鏈相互作用時被標記為紅色；（c）圖中E2s（I）、8G12Fab重鏈和8G12Fab輕鏈分別用紫色、深綠和淺綠表示；（d）圖中E2s側面靜電表面電位（紅色為負；藍色為正；灰色為中性）和8G12與E2S相互作用表位殘基；（e）圖中8C11與8G12在E2S上的結合區(qū)域，分別用灰色和黃色表示。圖1-28C11與8G12兩株單抗Fab段與E2S抗原蛋白復合體結構圖；（a）8C11單抗與E2S抗原復合物；（b）8C11單抗在E2S抗原結合表位；（c）8G12單抗與E2S抗原復合物；（d）8G12單抗在E2S抗原結合表位；（e）8C11與8G12單抗在E2S抗原結合表位1.2.3戊型肝炎實驗室診斷技術現狀及分析戊型肝炎的實驗室診斷手段多基于HEV抗原、HEVRNA和HEV血清抗體（主要包括lgG、lgM和lgA）檢測，可以根據不同的實驗目的選擇診斷方法。由于HEVlgM抗體較早出現于lgG抗體，HEV感染主要依靠血清中l(wèi)gM抗體的

第一章緒論11圖1-3本課題實驗流程圖1.5創(chuàng)新點目前由我國北京萬泰生物藥業(yè)公司獲得批準生產的人體血液HEVAg檢測試劑盒（ELISA）是目前全球唯一商業(yè)化HEVAg臨床診斷試劑盒，因靈敏度高、特異性良好在全球的戊型肝炎科學研究及臨床診斷中廣泛應用。近期有研究者在HEV患者尿液中發(fā)現了HEV抗原，并證明抗原排出體外的持續(xù)時間長于核酸，考慮到尿液樣本收集更加方便，本課題希望篩選出親和力高的HEVORF2單克隆抗體，制備成免疫熒光快檢試劑，可以快速、便捷的檢測尿液樣品中HEVAg，為今后的科學研究及醫(yī)療工作提供基矗1.篩選出HEVORF2高親和力、廣譜的單克隆抗體，對抗體進行型別、抗原表位結構分析，以及對單克隆抗體是否是HEVAg通過免疫原性刺激機體產生的血清中起主要結合作用的優(yōu)勢抗體進行分析，可以更加全面的了解單克隆抗體的性質，為后續(xù)實驗提供更好的數據支持。2.研發(fā)一種檢測HEVAg的免疫熒光快檢試劑，該試劑的檢測樣品為尿液，相比于血液樣品，尿樣采集更為方便；并且免疫熒光快檢試劑操作簡單方便、耗時短，可以滿足在醫(yī)療條件差或科研水平較低的地區(qū)完成HEV檢測等相關工作。

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]戊型肝炎病毒（HEV）組成和結構的分析及其ORF2蛋白在昆蟲細胞中表達的研究[D]. 齊影.吉林大學 2015



本文編號：3639706