本文關鍵詞：重組人甘露糖結(jié)合凝集素與人感染H7N9亞型流感病毒相互作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：甘露糖結(jié)合凝集素(Mannose-binding lectin, MBL)是存在于血清中的一種模式識別分子,可識別并結(jié)合多種微生物及凋亡細胞的表面特定己糖如甘露糖、N-乙酰葡糖胺等的一種宿主非特異性凝集素。已有研究表明MBL可通過結(jié)合季節(jié)性流感病毒表面的HA、NA發(fā)揮明確的抗病毒功效,但其對近年來新發(fā)、跨種屬傳播并感染人的禽流感病毒的效應尚不清楚。2013年,一種新型的可感染人的H7N9亞型流感病毒在我國出現(xiàn),患者表現(xiàn)為嚴重肺炎、呼吸窘迫綜合征,死亡率達40%之多。該病毒HA類似2012年浙江鴨中分離到的H7N3病毒,NA類似2011年韓國野鳥H7N9分離株,內(nèi)部6個基因片段同2012年禽中流行的H9N2病毒高度同源。本文使用重組人甘露糖結(jié)合凝集素(rhMBL)對分別帶有A/Anhui/1/2013(H7N9)、A/Hongkong/33982/2009(H9N2)表面HA、NA,內(nèi)部基因為A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)(PR8)的重配病毒(H7N9Vac和H9N2RG)及季節(jié)性流感毒株A/Brisbane/10/2007 (H3N2)進行相互作用及體外感染干擾試驗。首先采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)、血凝抑制實驗(HI)、神經(jīng)氨酸酶抑制實驗(NAI)來研究rhMBL對病毒表面糖蛋白HA、NA的結(jié)合及對其功能影響。其次我們進行了rhMBL對病毒一輪和多輪感染宿主靶細胞的影響,采用FITC標記的病毒,研究了感染早期,rhMBL對流感病毒與易感靶細胞(狗腎上皮細胞,MDCK)的結(jié)合、內(nèi)化作用的動態(tài)影響,評價了rhMBL調(diào)理后的病毒對人髓樣單核細胞系THP-1吞噬功能、人單核細胞來源的巨噬細胞(MDMs)的細胞因子產(chǎn)生情況的影響。本研究獲得以下主要結(jié)果：一、重組人甘露糖結(jié)合凝集素與病毒表面糖蛋白相互作用結(jié)果1.高病毒載量時,rhMBL對H7N9和H3N2流感病毒有較強的結(jié)合,對H9N2病毒的結(jié)合程度中等。2.rhMBL在高達3.67±0.33μg/mL可抑制H7N9病毒血凝活性,對2014年新出現(xiàn)的具有HA133糖基化位點的H7N9病毒(H7N9HA-A135S RG)血凝活性的抑制效應無明顯改變,而抑制H3N2、H9N2病毒血凝活性的效應濃度可低到0.026±0.001μg/mL和0.083±0.02μg/mL.3.rhMBL在高達10μg/mL時仍不能抑制H7N9病毒的神經(jīng)氨酸酶活性,但能明顯抑制H3N2、H9N2病毒神經(jīng)氨酸酶活性,最低效應濃度分別為0.0807±0.009μg/mL和0.0625μg/mL。4.rhMBL對H7N9病毒HA、NA功能活性的低效應可能同H7上N-糖基化位點(NGS)數(shù)目少、或HA頭部僅有的糖基化位點(240位)距HA受體結(jié)合區(qū)(RBD)遠、N9酶活功能區(qū)附近的關鍵糖基化位點(如NA234和402)缺失等結(jié)構(gòu)相關。二、rhMBL對病毒感染特性和調(diào)理后的病毒對免疫細胞活化的影響結(jié)果1.在10μg/mL,rhMBL仍無法中和H7N9病毒的感染力,但能抑制H3N2和H9N2病毒的感染,最低效應濃度分別為0.053±0.02μg/mL和0.78±0.16pg/mL。2.在3μg/mL,rhMBL無法有效阻斷高載量的H7N9病毒對易感靶細胞的一輪感染,但能阻斷H3N2和H9N2病毒的一輪感染。3.在3μg/mL,rhMB L無法抑制熒光標記的H7N9和H3N2病毒的內(nèi)化,可有效抑制熒光標記的H9N2病毒。4.3μg/mL的rhMBL促進了THP-1對H7N9、H9N2病毒的吞噬。5.H7N9病毒誘導MDMs分泌的TNF-α、RANTES、IP-10、MCP-1水平普遍高于H9N2病毒。rhMBL調(diào)理后的H7N9、H9N2病毒誘導MDMs分泌了更高水平的TNF-α、RANTES、IL-8。結(jié)論1.rhMBL可有效結(jié)合H7N9病毒,但在生理濃度范圍內(nèi),對病毒的血凝活性和神經(jīng)氨酸酶活性的抑制有限。rhMBL基本無法阻斷H7N9病毒進入靶細胞,不能發(fā)揮中和效應。2.rhMBL對H3N2和H9N2病毒則可發(fā)揮很好的血凝活性和神經(jīng)氨酸酶活性抑制,阻斷病毒進入靶細胞,在低濃度時即可有效中和病毒感染；3.rhMBL促進了THP-1對H7N9、H9N2病毒的吞噬,二者誘導MDMs產(chǎn)生更高水平的TNF-α、RANTES、IL-8;4.MBL這種存在于人體固有免疫系統(tǒng)中的關鍵分子,其對本研究中的這三種病毒的感染特性及病毒感染的免疫細胞活化發(fā)揮不同效應。MBL無法抑制H7N9的感染,且可增強免疫細胞的吞噬和細胞因子應答可能同H7N9致病機制相關,部分解釋了患者重癥的臨床表現(xiàn)。
【關鍵詞】：重組人甘露糖結(jié)合凝集素 H7N9流感病毒 感染力抑制 調(diào)理
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R511.7
【目錄】：

• 縮略詞表5-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 前言14-17
• 第一部分 重組人甘露糖結(jié)合凝集素與病毒表面糖蛋白相互作用研究17-37
• 1. 材料與方法17-28
• 2. 結(jié)果28-35
• 3. 討論35-36
• 4. 小結(jié)36-37
• 第二部分 重組人甘露糖結(jié)合凝集素對病毒感染特性和其調(diào)理后的病毒對免疫細胞功能的影響37-56
• 1. 材料與方法37-44
• 2. 結(jié)果44-52
• 3. 討論52-55
• 4. 小結(jié)55-56
• 全文討論與結(jié)論56-58
• 參考文獻58-61
• 綜述 人甘露糖結(jié)合凝集素在防治甲型流感病毒感染中的研究現(xiàn)狀與展望61-75
• 參考文獻71-75
• 致謝75-77
• 個人簡歷77-78
• 附錄 (已發(fā)表文章)78-82

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