發(fā)布時(shí)間：2021-05-09 23:21

　　目的:ACTs方案中雙氫青蒿素和哌喹聯(lián)合用藥在柬埔寨及鄰國(guó)被作為一線用藥,近幾年?yáng)|南亞地區(qū)抗性蟲(chóng)株有明顯擴(kuò)散趨勢(shì)。過(guò)去幾年,蛋白激酶和磷酸酶已經(jīng)成為藥物發(fā)現(xiàn)的熱門(mén)靶點(diǎn),NIF4與被認(rèn)為是一個(gè)潛在的ACT靶點(diǎn)ATG18在惡性瘧原蟲(chóng)基因組位置相鄰,蛋白磷酸酶NIF4為FCP1類NIFs,能催化RNA20polymerase20II20CTD的去磷酸化。RNA聚合酶II在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用是近年來(lái)研究的熱點(diǎn),但在瘧原蟲(chóng)方面研究甚少。本研究旨在探索NIF4能否成為ACTs抗性研究新靶點(diǎn),并初步了解蛋白磷酸酶NIF4蛋白質(zhì)作用過(guò)程,以幫助監(jiān)視、減緩和阻止抗瘧藥物耐藥性的傳播。研究方法:生物信息學(xué)分析PF3D7₁01270020NIF4蛋白結(jié)構(gòu)域、對(duì)其重要功能結(jié)構(gòu)域CPDc做系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)、跨膜區(qū)、信號(hào)肽以及蛋白3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè);通過(guò)構(gòu)建載體原核表達(dá)得到NIF4重組蛋白,免疫日本大耳兔獲得免疫血清;ELISA檢測(cè)NIF4多克隆抗體滴度;3D7進(jìn)行percoll分期,Western20blot及IFA實(shí)驗(yàn)對(duì)NIF4進(jìn)行亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析。惡性瘧原蟲(chóng)體外傳代培養(yǎng),進(jìn)行體外PPQ、DH... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)遼寧省

【文章頁(yè)數(shù)】：62 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語(yǔ)
1 前言
2 材料與方法
    2.1 主要試劑和儀器
        2.1.1 主要試劑
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 蟲(chóng)株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    2.2 主要研究方法
        2.2.1 NIF4 生物信息學(xué)分析
        2.2.2 惡性瘧原蟲(chóng)復(fù)蘇方法
        2.2.3 惡性瘧原蟲(chóng)體外培養(yǎng)方法
        2.2.4 惡性瘧原蟲(chóng)凍存方法
        2.2.5 提取惡性瘧原蟲(chóng)gDNA
        2.2.6 構(gòu)建NIF4 目的片段的重組質(zhì)粒
        2.2.7 重組蛋白原核表達(dá)及純化
        2.2.8 陽(yáng)性克隆小量表達(dá)與鑒定
        2.2.9 蛋白大量表達(dá)及破菌檢測(cè)
        2.2.10 包涵體蛋白純化
        2.2.11 Western blot檢測(cè)純化的重組蛋白
        2.2.12 重組蛋白多克隆抗體制備
        2.2.13 免疫原性檢測(cè)(ELISA檢測(cè)免疫效價(jià))
        2.2.14 抗體純化
        2.2.15 3D7全蟲(chóng)蛋白提取
        2.2.16 Western blot-NIF4 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.17 間接免疫熒光IFA-NIF4 蛋白定位
        2.2.18 3D7 各期蛋白提取
        2.2.19 流行區(qū)惡性瘧原蟲(chóng)野生株的采集
        2.2.20 哌喹及雙氫青蒿素藥物敏感性實(shí)驗(yàn)
            2.2.20.1 實(shí)驗(yàn)原理及實(shí)驗(yàn)要求
            2.2.20.2 實(shí)驗(yàn)步驟
        2.2.21 NIF4 片段PCR擴(kuò)增
        2.2.22 NIF4 片段PCR擴(kuò)增測(cè)序
3 結(jié)果
    3.1 NIF4 生物信息學(xué)分析
        3.1.1 NIF4 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)
        3.1.2 NIF4 信號(hào)肽預(yù)測(cè)
        3.1.3 NIF4 蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)
        3.1.4 CPDc結(jié)構(gòu)域系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析
        3.1.5 CPDc結(jié)構(gòu)域同源比對(duì)
        3.1.6 NIF4 蛋白的3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
    3.2 惡性瘧原蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)株3D7及DD2 的體外培養(yǎng)
    3.3 Western blot檢測(cè)純化的重組蛋白
    3.4 免疫血清免疫原性檢測(cè)
    3.5 抗體純化
    3.6 NIF4 蛋白定位
        3.6.1 Western blot-NIF4 蛋白惡性瘧原蟲(chóng)表達(dá)檢測(cè)
        3.6.2 IFA-NIF4 蛋白定位
    3.7 NIF4 蛋白惡性瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)不同時(shí)期表達(dá)
        3.7.1 3D7蟲(chóng)株生長(zhǎng)分期
        3.7.2 各分期蟲(chóng)株IFA-NIF4 蛋白定位
        3.7.3 各分期蟲(chóng)株Western blot-NIF4 蛋白定位及表達(dá)量比較
    3.8 中緬邊境惡性瘧原蟲(chóng)哌喹及雙氫青蒿素體外藥物敏感性測(cè)定
    3.9 NIF4 特異性片段PCR擴(kuò)增結(jié)果
    3.10 NIF4 氨基酸突變結(jié)果
    3.11 NIF4 氨基酸位點(diǎn)與PPQ及 DHA IC50 值的相關(guān)性
4 討論
5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性和自我評(píng)價(jià)
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個(gè)人簡(jiǎn)歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Antimalarial20qinghaosu/artemisinin:20The20therapy20worthy20of20a20Nobel20Prize[J]. Jerapan Krungkrai,Sudaratana Rochanakij Krungkrai.  Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2016(05)

碩士論文
[1]克欽邦佤邦惡性瘧原蟲(chóng)對(duì)氯喹等五種抗瘧藥抗性的體外測(cè)定[D]. 郝明明.昆明醫(yī)科大學(xué) 2013



本文編號(hào)：3178211