目的:本文基于卡介苗（BCG）和結(jié)核分枝桿菌H37Ra株感染人單核巨噬細(xì)胞系THP-1,外泌體分離、鑒定,轉(zhuǎn)錄組高通量測序,和生物信息學(xué)分析,選擇差異表達(dá)的miRNA,并經(jīng)初步臨床評估,以期望找到潛在的結(jié)核病新型標(biāo)志物。方法:（1）分別用BCG和H37Ra菌株分別對THP-1細(xì)胞系進(jìn)行感染,以未感染作為對照,培養(yǎng)72h后超速離心法提取細(xì)胞培養(yǎng)上清的外泌體,western blotting和透射電子顯微鏡鑒定外泌體。（2）提取外泌體總RNA后,經(jīng)新一代Illumina高通量測序,RNA-seq數(shù)據(jù)分析,多種生物信息學(xué)方法對測序結(jié)果進(jìn)行差異表達(dá)分析,靶基因預(yù)測,GO分析和KEGG信號通路分析。（3）選擇肺結(jié)核患者血清,健康人血清,用試劑盒提取其血清外泌體和miRNA,并用qPCR去驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA在臨床樣本中的表達(dá)情況。結(jié)果:（1）THP-1細(xì)胞在被細(xì)菌感染后出現(xiàn)偽足,呈巨噬細(xì)胞形態(tài),感染成功;Western blotting表明沉淀同時(shí)含有TSG101和CD9這兩種外泌體表面蛋白,透射電子顯微鏡表明沉淀直徑在30-150nm范圍內(nèi)且為杯狀雙層膜結(jié)構(gòu),結(jié)果表明沉淀為外泌體。（2）B... 

【文章來源】：武漢輕工大學(xué)湖北省

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
主要縮略詞
1 緒論
    1.1 結(jié)核病研究進(jìn)展
    1.2 結(jié)核外泌體研究進(jìn)展
    1.3 外泌體miRNA研究進(jìn)展
2 分枝桿菌感染THP-1細(xì)胞提取外泌體
    2.1 實(shí)驗(yàn)試劑、材料與儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 THP-1細(xì)胞系,結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)
        2.2.2 誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞貼壁
        2.2.3 外泌體的提取
        2.2.4 WB鑒定外泌體
        2.2.5 TEM鑒定外泌體
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)和感染
        2.3.2 WB結(jié)果
        2.3.3 TEM結(jié)果
    2.4 本章討論
3 外泌體miRNA測序及生物信息學(xué)分析
    3.1 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1.1 外泌體RNA提取及質(zhì)控
        3.1.2 RNA文庫質(zhì)控
        3.1.3 上機(jī)檢測
        3.1.4 miRNA生物信息學(xué)分析
    3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.2.1 外泌體RNA提取及質(zhì)控
        3.2.2 RNA文庫質(zhì)量控制結(jié)果
        3.2.3 miRNA差異表達(dá)分析
        3.2.4 差異表達(dá)miRNA靶基因預(yù)測
        3.2.5 差異表達(dá)miRNA靶基因GO分析
        3.2.6 差異表達(dá)miRNA靶基因KEGG pathway分析
    3.3 本章討論
4 qPCR驗(yàn)證血漿中miR-142-3p
    4.1 實(shí)驗(yàn)方法
        4.1.1 樣本準(zhǔn)備
        4.1.2 囊泡分離
        4.1.3 RNA分離
        4.1.4 反轉(zhuǎn)錄
        4.1.5 Real-time PCR
    4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.2.1 ROC曲線分析
        4.2.2 qPCR結(jié)果分析
    4.3 本章討論
5 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間的研究成果



本文編號：2996974