本文關(guān)鍵詞：探索分枝桿菌噬菌體對結(jié)核菌潛伏感染的應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的明確分枝桿菌噬菌體Leo的生物學(xué)和基因組學(xué)特征,篩選合適的結(jié)核休眠菌模型,并驗證分枝桿菌噬菌體Leo和Guo1是否可用于殺滅結(jié)核休眠菌,探索其應(yīng)用于結(jié)核菌潛伏感染治療的價值。方法1.分枝桿菌噬菌體Leo生物學(xué)特征采用雙層平板法制備噬菌體Leo,觀察噬菌斑形態(tài)；采用終點滴定反濁法測定恥垢分枝桿菌對噬菌體Leo的耐受突變率；檢測噬菌體Leo對酒精、溫度的耐受性及在不同pH下的裂解能力；通過體外殺結(jié)核分枝桿菌實驗,明確噬菌體Leo對結(jié)核分枝桿菌的殺滅作用。2.分枝桿菌噬菌體Leo基因組學(xué)特征提取噬菌體DNA,限制性內(nèi)切酶酶切分析確定其核酸類型；采用入噬菌體提取試劑盒提取噬菌體DNA,鳥槍法測序,得到的DNA序列用Phred/PhraD/Consedh軟件包組裝,拼接重疊群,PCR擴(kuò)增重疊群缺口。采用DNAStar軟件包、Glimmer3.0基因預(yù)測軟件、Promoter prediction/Prokaryotic程序進(jìn)行基因成分分析,基因功能預(yù)測,啟動子區(qū)預(yù)測,對Leo作共線性分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,同時利用Clustal X軟件分析Leo的motif 3基序。3.分枝桿菌噬菌體對結(jié)核休眠菌殺菌作用的初步探討3.1結(jié)核休眠菌模型比較初步研究利用缺氧因素構(gòu)建缺氧模型；利用低氧(5%O2)、高C02(10%C02)、弱酸(pH 5.0)及營養(yǎng)缺乏(10%7H9液體培養(yǎng)基)多種因素構(gòu)建多因素模型。分別在第20、30天時取樣,用金胺O-尼羅紅染色法染色,在共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)核菌脂質(zhì)聚集及失去抗酸性的情況；用電鏡觀察結(jié)核菌細(xì)胞壁增厚情況；并檢測其對利福平的耐藥率。在建模30天時,將等量的兩種模型分別轉(zhuǎn)入新鮮7H9液體培養(yǎng)基中,觀察并比較其自動復(fù)蘇情況。分別將缺氧模型建模11月及多因素模型建模53天的菌液加入羅氏培養(yǎng)管中,做可培養(yǎng)性檢測。3.2分枝桿菌噬菌體對結(jié)核休眠菌的殺菌作用利用缺氧因素構(gòu)建結(jié)核休眠菌模型,并將建模時間延長至一年以上；利用缺鉀因素構(gòu)建缺鉀模型,建模時間為35天；分別將兩模型菌液隨機(jī)分為5組,分別加入異煙肼(終濃度5μg/mL),利福平(終濃度5μg/mL),噬菌體Leo(滴度2.6×108PFU/mL),噬菌體Guol(滴度3.26×108PFU/mL),空白組加入等量ddH2O,共培養(yǎng)7天后行MPN法計數(shù),培養(yǎng)15天后刃天青顯色記錄結(jié)果,推算細(xì)菌濃度。結(jié)果1.分枝桿菌噬菌體Leo生物學(xué)特征Leo噬菌斑圓形透明,邊緣清晰；耐受突變率為10-7。Leo對溫度、酒精敏感,在pH 7.4和pH 5.0時均能裂解宿主菌。Leo作用于結(jié)核分枝桿菌72h后,Leo組菌量明顯低于空白組(P0.05)。2.分枝桿菌噬菌體Leo基因組學(xué)特征Leo基因組能被限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BglⅠ切開,全長39 981bp,GC含量66.86%,含3個可能的啟動子區(qū),不含串聯(lián)重復(fù)序列和tRNA區(qū)。Leo含59個基因,gene32編碼整合酶,不含編碼阻遏蛋白的基因和不利基因,Leo與BPs和Angel相似性最高,噬菌體Leo含有motif3基序。3.分枝桿菌噬菌體對結(jié)核休眠菌殺菌作用的初步探討3.1結(jié)核休眠菌模型比較初步研究在建模20天時,兩模型組細(xì)菌均出現(xiàn)脂質(zhì)聚集及失去抗酸性,無明顯差異。兩模型組細(xì)菌均未出現(xiàn)明顯細(xì)胞壁增厚。在建模30天時,多因素模型組細(xì)菌幾乎都表現(xiàn)出脂質(zhì)聚集及失去抗酸性,而缺氧模型組仍有部分細(xì)菌未表現(xiàn)出脂質(zhì)聚集及失去抗酸性。同時,多因素模型組在建模30天還出現(xiàn)了細(xì)胞壁增厚的細(xì)菌,缺氧模型組則無明顯改變。多因素模型組細(xì)菌對利福平的耐藥率明顯高于缺氧模型組,且多因素模型組細(xì)菌自動復(fù)蘇的菌量遠(yuǎn)小于缺氧模型組。但兩模型均不能使所有結(jié)核菌達(dá)到不可培養(yǎng)狀態(tài)。3.2分枝桿菌噬菌體對結(jié)核休眠菌的殺菌作用當(dāng)作用于缺氧模型誘導(dǎo)的休眠菌時,噬菌體Leo對結(jié)核休眠菌無殺滅作用,噬菌體Guol對結(jié)核休眠菌有明顯的殺滅作用,細(xì)菌量減少了3個數(shù)量級以上。而當(dāng)作用于缺鉀模型誘導(dǎo)的休眠菌時,噬菌體Leo可完全殺死結(jié)核休眠菌,而噬菌體Guo1僅能殺死一部分結(jié)核休眠菌。結(jié)論分枝桿菌噬菌體Leo是一株不含不利基因,含motif3基序的裂解性噬菌體,對結(jié)核分枝桿菌有較強的裂解能力。比較缺氧模型和多因素模型發(fā)現(xiàn),多因素模型可使結(jié)核菌更快進(jìn)入休眠狀態(tài),且更穩(wěn)定。但后期研究發(fā)現(xiàn)這兩種模型誘導(dǎo)的結(jié)核休眠菌休眠深度均不如缺鉀模型。同時,分枝桿菌噬菌體Leo和Guo1對結(jié)核休眠菌均有有裂解潛力,在潛伏結(jié)核感染的治療方面有較大潛能。
【關(guān)鍵詞】：分枝桿菌噬菌體 生物學(xué)特征 基因組學(xué) 結(jié)核休眠菌
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R52
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 前言15-16
• 第一部分 分枝桿菌噬菌體Leo生物學(xué)特征16-22
• 1 試劑和材料16-17
• 2 方法17-18
• 3 結(jié)果18-21
• 4 討論21-22
• 第二部分 分枝桿菌噬菌體Leo基因組學(xué)特征22-32
• 1 試劑和材料22-23
• 2 方法23-24
• 3 結(jié)果24-30
• 4 討論30-32
• 第三部分 分枝桿菌噬菌體對結(jié)核休眠菌殺菌作用的初步探討32-45
• 第一章 結(jié)核休眠菌模型比較初步研究32-39
• 1 試劑和材料32-33
• 2 方法33-35
• 3 結(jié)果35-39
• 第二章 分枝桿菌噬菌體對結(jié)核休眠菌的殺菌作用39-45
• 1 方法39-40
• 2 結(jié)果40-42
• 3 討論42-45
• 全文總結(jié)45-47
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 文獻(xiàn)綜述50-55
• 參考文獻(xiàn)53-55
• 致謝55-56
• 攻讀碩士學(xué)位期間研究成果56

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 甘易玲;郭述良;;結(jié)核休眠菌的治療及控制策略[J];中國人獸共患病學(xué)報;2014年02期

2 詹莉,戴華成,楊治平,易著文,成詩明,舒平;小毛莨內(nèi)酯對結(jié)核休眠菌感染病人GLS mRNA表達(dá)的影響[J];中國防癆雜志;2001年05期

3 甘易玲;郭述良;;噬菌體TM4復(fù)蘇結(jié)核休眠菌的初步研究[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2014年01期

4 ;[J];;年期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 江莉莎;探索分枝桿菌噬菌體對結(jié)核菌潛伏感染的應(yīng)用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：探索分枝桿菌噬菌體對結(jié)核菌潛伏感染的應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：295377