本文關鍵詞：探索分枝桿菌噬菌體對結核菌潛伏感染的應用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的明確分枝桿菌噬菌體Leo的生物學和基因組學特征,篩選合適的結核休眠菌模型,并驗證分枝桿菌噬菌體Leo和Guo1是否可用于殺滅結核休眠菌,探索其應用于結核菌潛伏感染治療的價值。方法1.分枝桿菌噬菌體Leo生物學特征采用雙層平板法制備噬菌體Leo,觀察噬菌斑形態(tài)；采用終點滴定反濁法測定恥垢分枝桿菌對噬菌體Leo的耐受突變率；檢測噬菌體Leo對酒精、溫度的耐受性及在不同pH下的裂解能力；通過體外殺結核分枝桿菌實驗,明確噬菌體Leo對結核分枝桿菌的殺滅作用。2.分枝桿菌噬菌體Leo基因組學特征提取噬菌體DNA,限制性內(nèi)切酶酶切分析確定其核酸類型；采用入噬菌體提取試劑盒提取噬菌體DNA,鳥槍法測序,得到的DNA序列用Phred/PhraD/Consedh軟件包組裝,拼接重疊群,PCR擴增重疊群缺口。采用DNAStar軟件包、Glimmer3.0基因預測軟件、Promoter prediction/Prokaryotic程序進行基因成分分析,基因功能預測,啟動子區(qū)預測,對Leo作共線性分析及構建系統(tǒng)進化樹,同時利用Clustal X軟件分析Leo的motif 3基序。3.分枝桿菌噬菌體對結核休眠菌殺菌作用的初步探討3.1結核休眠菌模型比較初步研究利用缺氧因素構建缺氧模型；利用低氧(5%O2)、高C02(10%C02)、弱酸(pH 5.0)及營養(yǎng)缺乏(10%7H9液體培養(yǎng)基)多種因素構建多因素模型。分別在第20、30天時取樣,用金胺O-尼羅紅染色法染色,在共聚焦顯微鏡下觀察結核菌脂質(zhì)聚集及失去抗酸性的情況；用電鏡觀察結核菌細胞壁增厚情況；并檢測其對利福平的耐藥率。在建模30天時,將等量的兩種模型分別轉入新鮮7H9液體培養(yǎng)基中,觀察并比較其自動復蘇情況。分別將缺氧模型建模11月及多因素模型建模53天的菌液加入羅氏培養(yǎng)管中,做可培養(yǎng)性檢測。3.2分枝桿菌噬菌體對結核休眠菌的殺菌作用利用缺氧因素構建結核休眠菌模型,并將建模時間延長至一年以上；利用缺鉀因素構建缺鉀模型,建模時間為35天；分別將兩模型菌液隨機分為5組,分別加入異煙肼(終濃度5μg/mL),利福平(終濃度5μg/mL),噬菌體Leo(滴度2.6×108PFU/mL),噬菌體Guol(滴度3.26×108PFU/mL),空白組加入等量ddH2O,共培養(yǎng)7天后行MPN法計數(shù),培養(yǎng)15天后刃天青顯色記錄結果,推算細菌濃度。結果1.分枝桿菌噬菌體Leo生物學特征Leo噬菌斑圓形透明,邊緣清晰；耐受突變率為10-7。Leo對溫度、酒精敏感,在pH 7.4和pH 5.0時均能裂解宿主菌。Leo作用于結核分枝桿菌72h后,Leo組菌量明顯低于空白組(P0.05)。2.分枝桿菌噬菌體Leo基因組學特征Leo基因組能被限制性內(nèi)切酶HindⅢ、BglⅠ切開,全長39 981bp,GC含量66.86%,含3個可能的啟動子區(qū),不含串聯(lián)重復序列和tRNA區(qū)。Leo含59個基因,gene32編碼整合酶,不含編碼阻遏蛋白的基因和不利基因,Leo與BPs和Angel相似性最高,噬菌體Leo含有motif3基序。3.分枝桿菌噬菌體對結核休眠菌殺菌作用的初步探討3.1結核休眠菌模型比較初步研究在建模20天時,兩模型組細菌均出現(xiàn)脂質(zhì)聚集及失去抗酸性,無明顯差異。兩模型組細菌均未出現(xiàn)明顯細胞壁增厚。在建模30天時,多因素模型組細菌幾乎都表現(xiàn)出脂質(zhì)聚集及失去抗酸性,而缺氧模型組仍有部分細菌未表現(xiàn)出脂質(zhì)聚集及失去抗酸性。同時,多因素模型組在建模30天還出現(xiàn)了細胞壁增厚的細菌,缺氧模型組則無明顯改變。多因素模型組細菌對利福平的耐藥率明顯高于缺氧模型組,且多因素模型組細菌自動復蘇的菌量遠小于缺氧模型組。但兩模型均不能使所有結核菌達到不可培養(yǎng)狀態(tài)。3.2分枝桿菌噬菌體對結核休眠菌的殺菌作用當作用于缺氧模型誘導的休眠菌時,噬菌體Leo對結核休眠菌無殺滅作用,噬菌體Guol對結核休眠菌有明顯的殺滅作用,細菌量減少了3個數(shù)量級以上。而當作用于缺鉀模型誘導的休眠菌時,噬菌體Leo可完全殺死結核休眠菌,而噬菌體Guo1僅能殺死一部分結核休眠菌。結論分枝桿菌噬菌體Leo是一株不含不利基因,含motif3基序的裂解性噬菌體,對結核分枝桿菌有較強的裂解能力。比較缺氧模型和多因素模型發(fā)現(xiàn),多因素模型可使結核菌更快進入休眠狀態(tài),且更穩(wěn)定。但后期研究發(fā)現(xiàn)這兩種模型誘導的結核休眠菌休眠深度均不如缺鉀模型。同時,分枝桿菌噬菌體Leo和Guo1對結核休眠菌均有有裂解潛力,在潛伏結核感染的治療方面有較大潛能。
【關鍵詞】：分枝桿菌噬菌體 生物學特征 基因組學 結核休眠菌
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R52
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 前言15-16
• 第一部分 分枝桿菌噬菌體Leo生物學特征16-22
• 1 試劑和材料16-17
• 2 方法17-18
• 3 結果18-21
• 4 討論21-22
• 第二部分 分枝桿菌噬菌體Leo基因組學特征22-32
• 1 試劑和材料22-23
• 2 方法23-24
• 3 結果24-30
• 4 討論30-32
• 第三部分 分枝桿菌噬菌體對結核休眠菌殺菌作用的初步探討32-45
• 第一章 結核休眠菌模型比較初步研究32-39
• 1 試劑和材料32-33
• 2 方法33-35
• 3 結果35-39
• 第二章 分枝桿菌噬菌體對結核休眠菌的殺菌作用39-45
• 1 方法39-40
• 2 結果40-42
• 3 討論42-45
• 全文總結45-47
• 參考文獻47-50
• 文獻綜述50-55
• 參考文獻53-55
• 致謝55-56
• 攻讀碩士學位期間研究成果56

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1 江莉莎;探索分枝桿菌噬菌體對結核菌潛伏感染的應用[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

  本文關鍵詞：探索分枝桿菌噬菌體對結核菌潛伏感染的應用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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