【研究背景】日本血吸蟲病至今仍是一個(gè)重大公共衛(wèi)生問(wèn)題,嚴(yán)重影響人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展,主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū),我國(guó)是日本血吸蟲病流行最嚴(yán)重的國(guó)家之一。日本血吸病主要危害就是肝臟的蟲卵性肉芽腫炎癥和隨后的肝臟纖維化,但至今尚無(wú)理想的的治療手段,因此在深入研究肝臟的肉芽腫炎癥和纖維化的相關(guān)機(jī)制的基礎(chǔ)上,尋找新的治療靶點(diǎn),對(duì)肝纖維化治療至關(guān)重要。Th17屬于CD4~+T細(xì)胞亞群,以大量分泌細(xì)胞因子IL-17為特征。RORγt是Th17分化過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,它通過(guò)直接激活I(lǐng)L-17的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)Th17的分化。p300是廣泛表達(dá)的乙酰轉(zhuǎn)移酶,主要由結(jié)構(gòu)域Bd、PHD、RING和HAT組成,其中HAT是乙酰轉(zhuǎn)移酶功能結(jié)構(gòu)域,Bd的功能是識(shí)別底物中乙酰化的賴氨酸并與之結(jié)合,以產(chǎn)生正反饋并維持p300的乙�；饔�,因此Bd對(duì)HAT的活性有重要調(diào)節(jié)作用。JQ1是溴結(jié)構(gòu)域和外終端域(BET)蛋白家族抑制劑,它可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合于Bd,阻止Bd與乙�；馁嚢彼峤Y(jié)合,從而導(dǎo)致乙酰化的組蛋白/非組蛋白無(wú)法與Bd結(jié)合招募更多的乙酰轉(zhuǎn)移酶p300,使p300的乙�；饔脽o(wú)法維持,抑制p300對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的促進(jìn)作用。本課題組前期研究表明:Th17/IL-17不僅促進(jìn)急性期蟲卵肉芽腫炎癥,還發(fā)揮重要的促纖維化功能;p300通過(guò)乙�；D(zhuǎn)錄因子RORγt的81位賴氨酸(K81),上調(diào)RORγt介導(dǎo)的IL-17的轉(zhuǎn)錄激活,從而促進(jìn)了Th17的分化。那么在血吸蟲感染模型中,JQ1是否可以通過(guò)抑制p300乙�；饔孟抡{(diào)RORγt介導(dǎo)的IL-17的轉(zhuǎn)錄,從而影響Th17的分化;繼而減輕肝臟蟲卵肉芽腫炎癥及纖維化呢?以及JQ1是否通過(guò)與p300競(jìng)爭(zhēng)溴結(jié)構(gòu)域(BRD)來(lái)發(fā)揮作用呢?【研究方法】1.日本血吸蟲感染小鼠模型的建立及JQ1處理為排除JQ1影響成蟲產(chǎn)卵的因素,本研究在血吸蟲感染的小鼠模型中,于感染6周后統(tǒng)一進(jìn)行吡喹酮灌胃殺蟲,再進(jìn)行JQ1處理。6~8周的SPF級(jí)C57/BL6小鼠隨機(jī)均分為3組,分別為正常對(duì)照組、DMSO溶劑對(duì)照組和JQ1處理組;經(jīng)皮感染感染日本血吸蟲尾蚴20±2條;感染后42天吡喹酮灌胃(300mg/kg/d),共2天;感染后45天開始注射JQ1(50mg/kg/d)/DMSO,共15天,感染后60天處死小鼠進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):(1)眼球取血分離血清,-80℃凍存,檢測(cè)轉(zhuǎn)氨酶水平;(2)成蟲和蟲卵計(jì)數(shù);(3)記錄小鼠體重、肝臟和脾臟的重量,計(jì)算肝脾系數(shù);(4)常規(guī)固定部分肝臟組織,石蠟包埋進(jìn),進(jìn)行HE染色、天狼星紅染色;(5)凍存部分肝組織:測(cè)肝臟組織中的羥脯氨酸含量;RT-qPCR檢測(cè)肝組織中的IL-17和RORγt的基因水平;(6)分離肝臟肉芽腫細(xì)胞:流式檢測(cè)IL-17和轉(zhuǎn)錄因子RORγt陽(yáng)性細(xì)胞數(shù);2.JQ1抑制p300乙酰酶活性的機(jī)制研究(1)兩段p300蛋白的表達(dá)和鑒定;經(jīng)過(guò)擴(kuò)增兩段p300目的基因,改造表達(dá)載體pcDNA3.1(+),構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ExpiCHO細(xì)胞,真核表達(dá)包含Bd和HAT結(jié)構(gòu)域的p300蛋白以及只有HAT結(jié)構(gòu)域的p300蛋白;(2)JQ1對(duì)兩段不同的p300蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的影響;JQ1(250nM)處理后的兩段p300蛋白4h,使用Histone Acetyltransferase Activity Assay Kit酶活試劑盒檢測(cè)乙酰酶活性�！狙芯拷Y(jié)果】1.JQ1減輕了日本血吸蟲蟲卵導(dǎo)致的肝臟肉芽腫炎癥和肝纖維化。2.JQ1下調(diào)肝組織中IL-17和RORγt的表達(dá)水平;肉芽腫細(xì)胞中Th17細(xì)胞比例。3.JQ1抑制含有Bd結(jié)構(gòu)域的p300蛋白的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性,而對(duì)不含Bd的p300蛋白的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性沒(méi)有明顯影響�！窘Y(jié)論】1.JQ1能夠減輕日本血吸蟲蟲卵導(dǎo)致的肝臟肉芽腫炎癥及肝纖維化;2.可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合Bd結(jié)構(gòu)域抑制p300的乙酰化下調(diào)RORγt介導(dǎo)的IL-17的轉(zhuǎn)錄,從而影響Th17的分化;繼而減輕蟲卵誘導(dǎo)的肝臟病變。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R532.21
【文章目錄】：
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中文摘要
ABSTRACT
1.前言
2.材料與方法
3.結(jié)果
4.討論
5.結(jié)論
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡(jiǎn)歷
致謝
綜述
    參考文獻(xiàn)

【參考文獻(xiàn)】

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