背景博爾納病病毒(BDV)是一種非節(jié)段單股負(fù)鏈RNA病毒,具有較強(qiáng)的嗜神經(jīng)特性。BDV感染的動(dòng)物種類十分廣泛,從嚙齒動(dòng)物到靈長(zhǎng)類動(dòng)物,還包括人類。BDV感染新生期嚙齒動(dòng)物的海馬和邊緣葉,導(dǎo)致認(rèn)知缺陷和精神行為異常,其癥狀與人類認(rèn)知和情感障礙比較類似。雖然BDV和人類之間有著密切的關(guān)系,但BDV在認(rèn)知障礙中發(fā)揮的作用仍然不清楚。有研究證明了表觀遺傳學(xué)(Epigenetic),特別是組蛋白乙�；�,在介導(dǎo)染色質(zhì)重塑和海馬依賴的認(rèn)知功能中起著關(guān)鍵作用,而記憶形成的關(guān)鍵是依賴突觸功能的可塑性,說(shuō)明記憶和突觸可塑性密切相關(guān),然而,BDV是否通過(guò)表觀遺傳學(xué)來(lái)影響突觸可塑性進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙目前還不得而知。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)或組蛋白去乙酰酶(HDACs)在調(diào)節(jié)組蛋白乙�；缴掀鹬鴽Q定性作用,任何酶活性異常都可以改變乙酰化組蛋白水平,并引起異�；虮磉_(dá)。辛二酰苯胺氧肟酸(SAHA)是HDAC抑制劑,已被證實(shí)其靶向抑制HDAC I類和IIb類,最終引起組蛋白乙�；险{(diào)。經(jīng)SAHA治療可以增強(qiáng)大鼠和小鼠的記憶形成能力,并在動(dòng)物模型中改善了神經(jīng)退行性疾病所致的記憶缺陷,而且已證明在皮層神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元實(shí)驗(yàn)室BDV株感染能影響特異位點(diǎn)組蛋白乙酰化,在此基礎(chǔ)上,研究BDV通過(guò)表觀遺傳學(xué)致使認(rèn)知障礙和SAHA能夠改善記憶能力可能的機(jī)制有著重要的意義。目的1.觀察BDV感染大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞后組蛋白乙�；屯挥|可塑性的表達(dá)水平,探討B(tài)DV在神經(jīng)元細(xì)胞中產(chǎn)生的影響。2.觀察BDV感染大鼠海馬組織后,大鼠的認(rèn)知能力以及組蛋白乙�；屯挥|可塑性的改變,探討B(tài)DV對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響和相關(guān)的機(jī)制。3.探討經(jīng)SAHA作用后,細(xì)胞和動(dòng)物水平發(fā)生的改變以及相關(guān)的機(jī)制。方法1.采用免疫熒光方法檢測(cè)BDV在細(xì)胞和動(dòng)物組織內(nèi)的感染情況。2.通過(guò)ChIP-seq方法找出與H3K9ac相互作用的突觸可塑性基因,并用RT-qPCR技術(shù)在mRNA水平檢測(cè)突觸可塑性基因的表達(dá)。3.利用Western blotting技術(shù)檢測(cè)組蛋白乙�；屯挥|可塑性蛋白的表達(dá)。4.水迷宮用于評(píng)價(jià)大鼠認(rèn)知能力。5.采用高爾基染色方法對(duì)海馬神經(jīng)元樹突分支和樹突棘密度進(jìn)行檢測(cè)。6.利用腦片膜片鉗技術(shù)評(píng)價(jià)大鼠LTP。結(jié)果1.免疫熒光結(jié)果顯示無(wú)論是細(xì)胞還是動(dòng)物體內(nèi),BDV都能充分感染,而正常對(duì)照組則不受BDV影響。2.利用Western blotting技術(shù)找到了BDV引起組蛋白乙�；年P(guān)鍵位點(diǎn)——H3K9ac,而ChIP-seq方法找出了與H3K9ac相互作用的突觸可塑性基因——PSD95、BDNF、PUM2、VAMP2、SYN1和DRD1。RT-qPCR和Western blotting發(fā)現(xiàn)BDV致使PSD95、BDNF、PUM2、VAMP2、SYN1顯著下調(diào),SAHA能逆轉(zhuǎn)PSD95、BDNF的表達(dá)水平且細(xì)胞和組織的驗(yàn)證具有一致性。3.水迷宮實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BDV可誘導(dǎo)大鼠認(rèn)知功能障礙,BDV組大鼠穿過(guò)平臺(tái)所在象限的次數(shù)明顯比CON組少(4.14±0.38 vs 6.50±0.62s,P0.05),而經(jīng)過(guò)SAHA治療后,BDV+SAHA組能顯著逆轉(zhuǎn)(6.79±0.65 vs 4.14±0.38s,P0.05),大鼠的認(rèn)知障礙有所改善。4.通過(guò)對(duì)高爾基進(jìn)行染色,發(fā)現(xiàn)BDV能致使海馬神經(jīng)元樹突分支和樹突棘密度顯著降低,但是SAHA能減輕BDV產(chǎn)生的影響。5.最后通過(guò)膜片鉗檢測(cè)LTP,CON組,BDV組和BDV+SAHA組的基線沒有差異,HFS能穩(wěn)定誘導(dǎo)CON組腦片LTP并能維持1h以上(CON:n=8,159.1±7.6%),而BDV組大鼠fEPSP波形的斜率明顯下降,LTP誘導(dǎo)明顯受損(BDV:n=6,133.9±6.4%,P0.01),在SAHA干預(yù)后,BDV所致的LTP受損情況明顯得到逆轉(zhuǎn)(BDV+SAHA:n=7,155.2±7.3%,P0.01)。結(jié)論1.BDV感染大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞后,H3K9ac和突觸可塑性基因與蛋白的表達(dá)顯著降低,BDV通過(guò)抑制突觸可塑性基因TSS的H3K9ac水平來(lái)降低突觸可塑性蛋白的表達(dá)。2.BDV感染大鼠海馬組織后,大鼠的認(rèn)知能力與H3K9ac介導(dǎo)的突觸可塑性的改變具有相關(guān)性,說(shuō)明BDV主要通過(guò)降低H3K9ac損傷大鼠認(rèn)知功能。3.SAHA能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞和動(dòng)物乙�；�,并改善BDV所致的大鼠認(rèn)知功能障礙。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R511;R749.2
【部分圖文】：

圖 1. ChIP-seq 實(shí)驗(yàn)篩選與突觸可塑性關(guān)聯(lián)的基因 （A）ChIP 具體流程；（B）高通量測(cè)序流程。Figure 1. ChIP-seq experimental screening associated with synaptic plasticity gene; (A) ChIspecific process; (B) High throughput sequencing process.1.2.10 SAHA 處理海馬神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)于已經(jīng)感染 BDV 的海馬神經(jīng)元細(xì)胞加入 SAHA 處理。在神經(jīng)元細(xì)胞感染BDV 8 天時(shí)，向培養(yǎng)皿中加入 1μl 10μM SAHA，輕輕搖勻后放入培養(yǎng)箱 24h。1.2.11 海馬神經(jīng)元細(xì)胞 RNA 提取與逆轉(zhuǎn)錄本實(shí)驗(yàn)采用 Trizol 法對(duì)三組神經(jīng)元細(xì)胞即未感染組（CON 組）、感染組（BD組）和感染后 SAHA 處理組（BDV+SAHA 組）的細(xì)胞 RNA 進(jìn)行提取，具體操作如下：A. 棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌 2 次，加入 1ml Trizol，用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下后

C. 誘導(dǎo) LTP：采用 100Hz 的高頻刺激（HPS）誘導(dǎo) LTP，產(chǎn)生 LTP 后持續(xù) 60min，統(tǒng)計(jì)其波形斜率相對(duì)于基線改變的百分比。.2.19 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)均采用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并以平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤（mean SE示。采用獨(dú)立樣本 t 檢驗(yàn)或單因素 ANOVA 統(tǒng)計(jì)分析，P < 0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)。 結(jié)果.1 海馬神經(jīng)元感染率和純度P24 蛋白是 BDV 主要表達(dá)蛋白之一，而神經(jīng)元又能特異性表達(dá) Map2 蛋白過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè) P24 和 Map2 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而檢測(cè) BDV 對(duì)神經(jīng)元染率和神經(jīng)元純度，圖 2 為免疫熒光結(jié)果。

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文為了研究 BDV 感染神經(jīng)元后對(duì)組蛋白乙�；稽c(diǎn)的影響，采用 Westerblotting 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，BDV 感染后 H3K9ac 比對(duì)照組下調(diào)了 41.81%，P 0.01（圖 3），而其他位點(diǎn)如 H2BK5ac，H2BK20ac，H3K14ac，和 H4K16ac 兩組之間沒有顯著差異，P > 0.05。因此，針對(duì) H3K9 ac 這個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)研究
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本文編號(hào)：2855464