發(fā)布時(shí)間：2020-10-22 05:11

　　 第一部分構(gòu)建雙核酶自切割HCV JFH1復(fù)制子并研究其體內(nèi)外復(fù)制特性背景和目的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)基因組長(zhǎng)度為9.6kbp,是正鏈RNA病毒,其基因組由編碼區(qū)、非編碼區(qū)兩部分構(gòu)成。編碼區(qū)包含:核心蛋白區(qū)、包膜蛋白區(qū)、P7蛋白區(qū)、非結(jié)構(gòu)區(qū);非編碼區(qū)是由5’與3’非編碼區(qū)組成。HCV是導(dǎo)致慢性丙型肝炎、肝硬化、肝癌的主要病原體,目前已有越來(lái)越多的人受到該病毒的困擾,但迄今為止依然沒(méi)有對(duì)應(yīng)有效的疫苗。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì),目前全世界范圍內(nèi)共有1.8億慢性丙型肝炎患者,HCV防治已經(jīng)成為我國(guó)乃至全球的最主要公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前HCV的治療主要依靠聚乙二醇干擾素(pegylated interferon,PEG-IFN)聯(lián)合利巴韋林(ribavirin,RBV),但其療效有限,且在不同的HCV基因型間,療效差異明顯,所以目前迫切的需要研制出更有效的抗HCV藥物,為臨床的治療提供幫助。但在進(jìn)行新的抗HCV藥物研制中,受制于缺乏合適的HCV感染模型,導(dǎo)致研究工作進(jìn)程中困難重重�，F(xiàn)在已有報(bào)道已經(jīng)在HCV JFH1的基礎(chǔ)上構(gòu)建了多順?lè)醋�、單順�(lè)醋拥腍CV全長(zhǎng)基因組、亞基因組復(fù)制子,但是這種類型的復(fù)制子雖然可以啟動(dòng)病毒的復(fù)制,但產(chǎn)生不了具有包膜的完整病毒,限制了HCV生物學(xué)特性的研究;Kato等發(fā)明了一個(gè)新的方法,通過(guò)人工體外轉(zhuǎn)錄的方式合成了JFH1全長(zhǎng)RNA,利用電轉(zhuǎn)染進(jìn)Huh7.5細(xì)胞并啟動(dòng)HCV的合成,但這個(gè)方法操作過(guò)程極其復(fù)雜,而且不能用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),也不能用來(lái)建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,具有很大的局限性;在體內(nèi)的模型研究中,已知黑猩猩對(duì)HCV敏感并可以表現(xiàn)出相似的肝炎病程,但是由于倫理、經(jīng)濟(jì)的緣故,很難將黑猩猩用作動(dòng)物模型;鑒于此,構(gòu)建合適的HCV全長(zhǎng)基因組體內(nèi)和體外復(fù)制模型,是更深入的進(jìn)行hcv研究工作的重要基礎(chǔ)。本研究基于jfh1cdna序列,建立了雙核酶自切割hcv全基因組復(fù)制子,該復(fù)制子可在細(xì)胞內(nèi)直接啟動(dòng)hcv復(fù)制,并包裝出具有感染性的病毒顆粒,病毒進(jìn)行復(fù)制、包裝、釋放、重新感染的過(guò)程,保持了培養(yǎng)系統(tǒng)里hcv長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定和高效率的復(fù)制,模擬了hcv完整的生命周期循環(huán),可用于hcv生物學(xué)特性研究及抗hcv藥物長(zhǎng)期的觀察和篩選。并且該復(fù)制子也可進(jìn)行動(dòng)物模型的研究。方法1.在hcvjfh1及hcvjfh1/gnd的cdna序列兩側(cè)分別利用pcr基因重組技術(shù)加上核酶序列,分別與真核表達(dá)載體pcdna3.1進(jìn)行基因重組,構(gòu)建含雙核酶自切割序列hcvjfh1全基因組復(fù)制子,即重組質(zhì)粒pcdna3.1-rz-jfh1和其陰性突變株pcdna3.1-rz-jfh1/gnd。2.我們把構(gòu)建的復(fù)制子化學(xué)轉(zhuǎn)染進(jìn)huh7.5細(xì)胞、通過(guò)尾靜脈高壓注射進(jìn)行昆明小鼠的實(shí)驗(yàn)。觀察細(xì)胞培養(yǎng)上清hcvrna、小鼠血清hcvrna水平;細(xì)胞免疫熒光、免疫組化學(xué)染色和相關(guān)的血清學(xué)檢查分別測(cè)試該復(fù)制子的體內(nèi)和體外復(fù)制的特點(diǎn)。主要結(jié)果1.雙核酶自切割hcvjfh1全基因組復(fù)制子構(gòu)建成功:重組質(zhì)粒pcdna3.1-rz-jfh1及pcdna3.1-rz-jfh1/gnd,經(jīng)ecori、xbai酶切鑒定,酶切條帶大小均與預(yù)期一致,重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.在16周的檢測(cè)期內(nèi),從轉(zhuǎn)染pcdna3.1-rz-jfh1復(fù)制子的huh7.5培養(yǎng)液中長(zhǎng)時(shí)間平穩(wěn)的檢測(cè)出hcvrna,其拷貝數(shù)可達(dá)到1×106~3×106/ml。pcdna3.1-rz-jfh1/gnd細(xì)胞培養(yǎng)上清中的hcvrna水平一直低于檢測(cè)下限。3.復(fù)制子pcdna3.1-rz-jfh1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中出現(xiàn)hcv核心抗原染色陽(yáng)性細(xì)胞約占20%;hcv感染組細(xì)胞中出現(xiàn)hcv核心抗原染色陽(yáng)性的細(xì)胞約占5%。復(fù)制系統(tǒng)里包裝出的的病毒顆粒有感染性,可以感染新的huh7.5細(xì)胞。4.短期的病毒血癥在尾靜脈高壓注射了hcvjfh1復(fù)制子的昆明小鼠中被檢出,隨后進(jìn)行的其肝臟免疫組化染色中,hcv抗原陽(yáng)性細(xì)胞未被觀察到,同時(shí)小鼠血清中也未能檢測(cè)到hcv抗體。結(jié)論本研究建立的hcvjfh1全長(zhǎng)復(fù)制子可以在體外培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間、平穩(wěn)、高效地包裝出具有感染性的hcv病毒顆粒,但在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,未能取得理想效果;可能是hcvjfh1病毒株來(lái)源的特殊性導(dǎo)致了這種結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的hcvjfh1全長(zhǎng)基因組復(fù)制子了,在hcv生物學(xué)特性研究和抗hcv藥物測(cè)試等方面可以起到很大的作用。第二部分聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療hcv6型感染者的臨床療效回顧性分析背景與目的研究發(fā)現(xiàn),聚乙二醇干擾素(pegylatedinterferon,peg-ifn)聯(lián)合利巴韋林(ribavirin,rbv)治療hcv,已經(jīng)成為臨床醫(yī)生的共識(shí),但是療效上卻取決于hcv感染的基因型,不同的基因型所取得的持續(xù)性病毒學(xué)應(yīng)答(sustainedvirologicalresponse,svr)率有明顯差異,有研究提示hcv1型最低,只有40-50%左右,hcv2/3型可達(dá)到70-80%,甚至可以更高。hcv共有6個(gè)基因型,其中1型、2型和3型呈全世界分布,而4型、5型主要分布在非洲,6型主要流行于亞洲。由于世界經(jīng)濟(jì)及醫(yī)療衛(wèi)生的格局,hcv4型、5型、6型的研究甚少,主要的研究集中在hcv1型、2/3型。近年來(lái),我國(guó)醫(yī)療衛(wèi)生條件的改善,hcv的傳播方式發(fā)生了改變,輸血和使用血液制品導(dǎo)致的hcv感染已經(jīng)明顯下降,隨之而來(lái)的是靜脈吸毒導(dǎo)致的hcv感染比例明顯提高。由于靜脈吸毒史是導(dǎo)致hcv6型感染的主要原因,所以我們國(guó)家的hcv6型感染者比例呈上升趨勢(shì),有研究表明,這種趨勢(shì)尤其以我國(guó)西南地區(qū)為甚,這可能與我國(guó)西南地區(qū)毗鄰東南亞全球毒品主要生產(chǎn)地之一的緣故。hcv6型感染者的比例不斷升高,對(duì)我們的臨床治療提出了規(guī)范化要求。目前hcv1型和2/3型感染者臨床上均有標(biāo)準(zhǔn)的治療方案,但hcv6型感染者的治療方式及療程還需進(jìn)一步探討、商榷并確定。曾經(jīng)有報(bào)道分析hcv1型、2/3型、6型病例的peg-ifn聯(lián)合rbv抗病毒治療效果,研究發(fā)現(xiàn),hcv1型治療效果最差,而hcv6型病例治療效果明顯好于hcv1型,但是和hcv2/3型病例的抗病毒療效無(wú)明顯差異。另外有研究將hcv6型分別應(yīng)用了24w和48w的peg-ifn聯(lián)合rbv的病例入組,比較兩者在治療時(shí)間上抗病毒效果的差異,最后發(fā)現(xiàn)兩者的療效沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異。由于目前有大量的報(bào)道都認(rèn)為hcv6型病例應(yīng)用peg-ifn聯(lián)合rbv治療24w取得的效果可以達(dá)到hcv2/3型同樣治療方案的水平。本研究在重慶第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院感染科的所有門(mén)診和住院的病人中,收集了2010年5月-2014年10月應(yīng)用peg-ifn聯(lián)合rbv治療的hcv6型、2/3型感染者的詳細(xì)病例資料進(jìn)行回顧性分析,經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的入組篩選過(guò)程,我們最終入組了137例病人。hcv6型患者53例,hcv2/3型患者84例。通過(guò)比較基線資料,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的病毒應(yīng)答情況來(lái)比較兩組間療效的差別,用來(lái)對(duì)臨床工作作出指導(dǎo)。方法收集重慶西南醫(yī)院感染病�？漆t(yī)院2010年5月至2014年10月所有門(mén)診和住院期間應(yīng)用peg-ifn聯(lián)合rbv治療的hcv6型感染者和2/3型感染者的臨床資料(年齡、性別、hcvrna水平、alt水平、腹部彩超結(jié)果、感染途徑、治療過(guò)程),進(jìn)行病例入組,所有納入病例符合以下納入條件:(1)利巴韋林每日用量針對(duì)體重65kg、65-85kg、85kg的病人分別為800mg、1000mg、1200mg;派羅欣皮下注射180μg/周;佩樂(lè)能每周皮下注射1.5μg/kg;(2)治療時(shí)間大于等于24周,小于等于26周。并且有6個(gè)月以上隨訪完整資料;(3)排除hbv、hiv、糖尿病、高血壓、自身免疫性肝病等疾病。將患者分為hcv6型與2/3型感染者兩組,分別對(duì)兩組患者的rvr、evr、svr進(jìn)行比較。采用spss18.0軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)的方式標(biāo)出。t檢驗(yàn)被應(yīng)用到對(duì)基線計(jì)量資料的比較中;率的比較采用χ2檢驗(yàn);對(duì)感染者基線資料與最終抗病毒療效的影響,采用多因素logistic回歸分析;對(duì)療效評(píng)價(jià)采用非劣效檢驗(yàn),即當(dāng)試驗(yàn)組非劣于對(duì)照組時(shí),認(rèn)為試驗(yàn)成功。經(jīng)臨床專家商討,非劣效性界值△=15%,p0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)。主要結(jié)果1.hcv6型與2/3型感染者年齡及性別分布、治療前血清hcvrna與alt水平以及應(yīng)用peg-ifn種類均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但吸毒史在hcv6型感染者中的比例高于hcv2/3型感染者所占的比例(p=0.001)。2.hcv6型、2/3型感染者獲得rvr比例分別是88.7%、89.3%,率差95%可信區(qū)間為:(-0.1139,0.1019);獲得evr的比例分別是94.3%、96.4%,率差95%可信區(qū)間為:(-0.0950,0.0530);獲得svr的比例分別是86.8%、90.5%,率差95%可信區(qū)間為:(-0.1476,0.0736);hcv6型、2/3型感染者rvr對(duì)svr的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為89.4%、93.3%,率差95%可信區(qū)間為:(-0.1436,0.0656);EVR對(duì)SVR的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為88.0%、91.4%,率差95%可信區(qū)間為:(-0.1428,0.0748)。上述指標(biāo)的率差95%可信區(qū)間下限均小于非劣效性界值0.15,非劣效性檢驗(yàn)成立,可以認(rèn)為在上述各項(xiàng)指標(biāo)的比較中,HCV 6型感染者非劣于HCV 2/3型感染者。3.有無(wú)吸毒史對(duì)HCV 6型感染者各個(gè)識(shí)相點(diǎn)的治療應(yīng)答影響均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論采用聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療HCV 6型感染者的療效非劣于HCV2/3型感染者,故我們可以把24周的標(biāo)準(zhǔn)PEG-IFN聯(lián)合RBV療法作為臨床上HCV6型的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R512.63
【文章目錄】：
縮略語(yǔ)表
英文摘要
中文摘要
第一部分 構(gòu)建雙核酶自切割 HCV JFH1 復(fù)制子 并研究其體內(nèi)外復(fù)制特性
    1. 前言
    2. 試劑與材料
    3. 實(shí)驗(yàn)方法
    4. 結(jié)果
    5. 討論
第二部分 聚乙二醇干擾素聯(lián)合利巴韋林治療 HCV6型 感染者的臨床療效回顧性分析
    1. 前言
    2. 研究對(duì)象與方法
    3. 結(jié)果
    4. 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述 HCV 6 型的流行病學(xué)及治療現(xiàn)狀
    參考文獻(xiàn)
碩士在讀期間所發(fā)表的論著文章
致謝

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1 何長(zhǎng)龍;HCV全基因組復(fù)制子的構(gòu)建及HCV6型患者PEG-IFN療效分析[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2851143