以登革熱為代表的蚊媒傳病已經(jīng)成為十分重要而且緊急的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球每年約有一半的人有感染此類疾病的危險(xiǎn)。伊蚊是傳播登革熱的主要媒介。登革熱主要有四個(gè)血清型病毒,由于目前還沒(méi)有有效的疫苗來(lái)預(yù)防感染,因此通過(guò)切斷傳播途徑來(lái)防治登革熱的傳播至關(guān)重要。現(xiàn)今主要是通過(guò)物理方法和化學(xué)方法來(lái)消滅媒介蚊蟲(chóng),但是對(duì)環(huán)境會(huì)造成不可逆的污染,對(duì)非目標(biāo)物種也會(huì)造成一定程度的損傷,且逐步增加蚊蟲(chóng)的抗藥性。因此,急需一種對(duì)環(huán)境友好,對(duì)生態(tài)可持續(xù)發(fā)展的有效生物策略來(lái)防控蚊媒疾病的傳播。RNAi作為一種反向遺傳工具,能夠?qū)δ康幕蜻M(jìn)行敲除,以實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控功能。HR3(孤兒核受體,Hormone receptor 3)在昆蟲(chóng)生殖發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用,參與卵母細(xì)胞的成熟及雌性伊蚊產(chǎn)卵過(guò)程,同時(shí)調(diào)節(jié)蛻皮和昆蟲(chóng)蛹的形成,若敲除該基因,則將導(dǎo)致昆蟲(chóng)不能進(jìn)行正常蛻皮,幼蟲(chóng)迅速死亡。羥基犬尿素(3-HK)是伊蚊體內(nèi)高活性的中間體,容易氧化生成大量的活性氧,導(dǎo)致伊蚊死亡。3HKT(羥基犬尿氨酸轉(zhuǎn)氨酶,3-hydroxykynurenine Transaminase)催化3-HK轉(zhuǎn)化為黃尿烯酸,阻斷該活性氧產(chǎn)生途徑,有利于伊蚊正常生長(zhǎng)發(fā)育。目的:編碼HR3和3HKT兩個(gè)蛋白的基因做為RNAi靶基因,在衣藻中表達(dá)后飼喂伊蚊幼蟲(chóng),作用于伊蚊幼蟲(chóng)體內(nèi)HR3和3HKT基因,降低其表達(dá)水平,從而確定工程藻株對(duì)伊蚊的致死作用,為生物滅蚊打下基礎(chǔ),達(dá)到生物防治登革熱的目的。方法:對(duì)伊蚊的HR3和3HKT兩個(gè)基因進(jìn)行克隆,構(gòu)建RNAi表達(dá)載體,將其轉(zhuǎn)化進(jìn)萊茵衣藻CC425藻株,喂食埃及伊蚊幼蟲(chóng)。對(duì)伊蚊幼蟲(chóng)進(jìn)行生物學(xué)檢測(cè),細(xì)胞組織觀察,RNA水平檢驗(yàn),確定轉(zhuǎn)基因工程藻株滅蚊效果。結(jié)果:生物學(xué)觀察,喂食HR3和3HKT轉(zhuǎn)基因藻株的幼蟲(chóng)較對(duì)照組幼蟲(chóng)生長(zhǎng)顯著緩慢。飼喂轉(zhuǎn)基因藻株的幼蟲(chóng)在第20小時(shí)就有死亡現(xiàn)象發(fā)生,并且喂食3HKT轉(zhuǎn)基因藻株的幼蟲(chóng)較喂食HR3轉(zhuǎn)基因藻株的幼蟲(chóng)死亡更為迅速。病理組織切片觀察,喂食轉(zhuǎn)基因衣藻的幼蟲(chóng)在表皮、中腸等部位均出現(xiàn)了不同程度的破壞。RNA水平檢測(cè),喂食轉(zhuǎn)基因藻株的幼蟲(chóng)其靶基因表達(dá)水平均出現(xiàn)了不同程度的下降。結(jié)論:RNAi轉(zhuǎn)基因藻株在伊蚊幼蟲(chóng)體內(nèi)發(fā)生RNA干擾作用,降低HR3和3HKT的表達(dá)水平,最終阻礙伊蚊的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程,導(dǎo)致伊蚊幼蟲(chóng)的死亡。本研究為生物策略防控蚊媒傳病提供了一定的技術(shù)途徑和方法,為大規(guī)模防控蚊媒疾病貢獻(xiàn)了新的思路。
【學(xué)位單位】：海南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R512.8;R184.3
【部分圖文】：

圖 1.2 HR3 蛋白保守區(qū)域多序列比對(duì)Figure. 1.2 Multi-sequence comparison of conserved region of HR3 protein利用 ProtParam 對(duì) HR3 核酸序列進(jìn)行分析（表 1.1），HR3 蛋白質(zhì)分子式為 C2341H3700N640O722S32，理論分子量為 53388.91，等電點(diǎn)為 5.66，半衰期為 30小時(shí)，不穩(wěn)定參數(shù)為 50.99，為不穩(wěn)定蛋白。組成蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)量為 468，主要的氨基酸為：絲氨酸 Ser（41 個(gè)，占 8.8%），亮氨酸 Leu（41 個(gè)，占 8.8%），谷氨酸 Glu（32 個(gè)，占 6.8%），纈氨酸 Val（29 個(gè)，占 6.2%），天冬氨酸 Asp（29 個(gè)，占 6.2%），谷氨酰胺 Gln（28 個(gè)，占 6.0%），異亮氨酸 Ile（28 個(gè)，占 6.0%），丙氨酸 Ala（26 個(gè)，占 5.6%），蘇氨酸 Thr（26 個(gè)，占 5.6%），精氨酸 Arg（26 個(gè)，占 5.6%），賴氨酸 Lys（25 個(gè)，占 5.3%），甘氨酸 Gly（22 個(gè)，占 4.7%），甲硫氨酸 Met（21 個(gè)，占 4.5%），苯丙氨酸 Phe（19 個(gè)，占 4.1%），酪氨酸 Tyr（19 個(gè)，占 4.1%），酪氨酸 Tyr（19 個(gè)，占 4.1%），

圖 1.3 HR3 跨膜結(jié)構(gòu)域分析Figure. 1-3 Cross-membrane domain analysis of HR3（2）昆蟲(chóng) HR3 基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)HR3 基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，總結(jié)了 HR3 基因家族的進(jìn)化關(guān)系。從 GenBank 中搜索到 15 種相關(guān)昆蟲(chóng)的 HR3 序列，通過(guò) MEGA7 軟件構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖1.4.A）。從進(jìn)化樹(shù)中可以看出，埃及伊蚊 HR3 基因序列與白紋伊蚊及其相似，同源率達(dá)到 99%，其次是蠅屬，與玉帶鳳蝶的同源性最差，同源率只有 71%。利用在線工具 GSDS 繪制基因結(jié)構(gòu)，如圖 1.4.B 所示，外顯子和內(nèi)含子分別用黃色矩形和細(xì)線表示，未翻譯的區(qū)域（UTRs）用藍(lán)色框表示，底部比例尺估計(jì)外顯子和內(nèi)含子的大小。HR3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域利用在線工具 Smart 和 Pfam 共同得出。不同的域用不同顏色的框表示，標(biāo)志在右下角，借助底部的比例尺可以明確蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和大�。▓D 1.4.C）。

12圖 1.6 3HKT 蛋白保守區(qū)域Figure. 1.6 Multi-sequence comparison of 3H利用 ProtParam 對(duì) 3HKT 核酸序列進(jìn)行分式為 C1935H3039N519O554S25，理論分子量為 43230 小時(shí)，不穩(wěn)定參數(shù)為 38.63，為不穩(wěn)定蛋白。主要的氨基酸為：亮氨酸 Leu（37 個(gè)，占 9.5%）異亮氨酸 Ile（29 個(gè)，占 7.5%），丙氨酸 Ala（24 個(gè)，占 6.2%），脯氨酸 Pro（24 個(gè)，占6.2%），纈氨酸 Val（24 個(gè)，占 6.2%），精氨氨酸 Lys（19 個(gè)，占 4.9%），天冬氨酸 Asp（（17 個(gè)，占 4.4%），天冬酰胺 Asn（15 個(gè)，占

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