【摘要】：研究背景發(fā)熱伴血小板減少綜合征(Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome,SFTS)是一種新發(fā)的病毒性蜱媒傳染病,該疾病于2009年首先在中國(guó)內(nèi)陸地區(qū)被發(fā)現(xiàn),病原體被確證命名為嚴(yán)重發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(SFTSV),是一種新型的布尼亞病毒。截止到2017年初,在中國(guó)共有23個(gè)省份有相關(guān)病例報(bào)道,平均死亡率約為5.3%。世界衛(wèi)生組織已連續(xù)數(shù)年將其列入年度優(yōu)先關(guān)注的十大疾病之中(WHO disease priority blueprint)。然而,對(duì)此病毒的致病機(jī)制以及病毒宿主間相互作用的認(rèn)識(shí)還比較匱乏。其中因血小板嚴(yán)重減少導(dǎo)致的出血傾向和免疫抑制引起病毒的持續(xù)復(fù)制被認(rèn)為是SFTS的兩大重要特征和致死因素。研究目的本研究旨在利用代謝組學(xué)分析SFTSV對(duì)宿主病人代謝的影響,發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證潛在異常的代謝途徑及其生物學(xué)效應(yīng),后利用臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)和體外細(xì)胞模型對(duì)病毒引起的代謝異常及其生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。從而探究該病毒的發(fā)病特征和致病機(jī)理,并為后續(xù)臨床應(yīng)用篩選可能的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。研究方法和技術(shù)手段本研究第一部分利用基于LC-MS/MS的靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)來(lái)自兩個(gè)人群的獨(dú)立樣本進(jìn)行了血清代謝組學(xué)分析。第二部分采用病例對(duì)照的組間比較,并運(yùn)用全自動(dòng)氨基酸譜分析、流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、Primeflow原位RNA檢測(cè)等技術(shù)手段對(duì)精氨酸代謝異常及其生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析及生物學(xué)效應(yīng)分析。第三部分采用臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn),沿用第二部分的技術(shù)手段,對(duì)精氨酸的生物學(xué)效應(yīng)及其干預(yù)效果進(jìn)行了驗(yàn)證。最后兩部分回顧性分析了SFTS病例中內(nèi)皮細(xì)胞功能相關(guān)的臨床特征并依靠所構(gòu)建的體外細(xì)胞感染模型,利用激光共聚焦顯微鏡、熒光定量PCR、Transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室、Luminex液相芯片等技術(shù),從臨床和體外兩個(gè)方面對(duì)精氨酸代謝異�？赡苊闇�(zhǔn)的另一靶標(biāo):血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙進(jìn)行了驗(yàn)證。研究結(jié)果一、發(fā)熱伴血小板減少綜合征代謝組學(xué)關(guān)聯(lián)研究在第一組和第二組人群中分別檢測(cè)到63種和103種代謝物的相對(duì)豐度。采用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA),發(fā)現(xiàn)主要差異代謝物可將各組人群進(jìn)行較好區(qū)分。根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果在第一組和第二組人群中分別篩選出28個(gè)和41個(gè)差異代謝物,共有54種差異代謝物。通過(guò)代謝通路分析發(fā)現(xiàn)了數(shù)條有顯著意義的代謝通路。其中,精氨酸,脯氨酸代謝通路同時(shí)具有最高的通路影響因子(Pathway impact)且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。此外,精氨酸相關(guān)代謝物濃度與臨床預(yù)后密切相關(guān)。二、精氨酸代謝異常的病例對(duì)照組間比較與生物學(xué)效應(yīng)分析在研究第二部分驗(yàn)證人群的病例對(duì)照組間比較中,精氨酸和瓜氨酸在感染急性期發(fā)生顯著降低(P0.001),鳥(niǎo)氨酸明顯上升。整體精氨酸的生物利用度(GABR)顯著下降,且在死亡病例中尤為明顯。同時(shí),與精氨酸代謝關(guān)系密切的骨髓源性抑制細(xì)胞的比例及其胞內(nèi)精氨酸酶的表達(dá)明顯上升(P0.001),受精氨酸調(diào)控的T細(xì)胞受體CD3ζ鏈在CD4淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生明顯下調(diào)(P0.001)。精氨酸在血小板內(nèi)的代謝產(chǎn)物血小板一氧化氮發(fā)生顯著下調(diào)(P0.001)。這些因素與精氨酸水平呈現(xiàn)明顯相關(guān)關(guān)系,并與血小板數(shù)量、病毒載量等臨床表型密切相關(guān)。因此,推測(cè)精氨酸下降可能與免疫抑制和血小板減少的調(diào)控的有關(guān),并引起了相應(yīng)的臨床改變。三、精氨酸干預(yù)發(fā)熱伴血小板減少綜合征的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果表明,在精氨酸用藥組人群中,血小板一氧化氮明顯上升,T淋巴細(xì)胞CD3ζ鏈上調(diào),病毒清除和血小板恢復(fù)速度加快。四、發(fā)熱伴血小板減少綜合征內(nèi)皮細(xì)胞損傷的回顧性分析及病例對(duì)照研究結(jié)果顯示,18.3%的SFTS患者在感染期間出現(xiàn)了滲漏癥狀,32.3%的患者出現(xiàn)出血癥狀,均為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要臨床表現(xiàn),SFTS患者血清中的多種粘附因子濃度發(fā)生顯著上調(diào),提示內(nèi)皮細(xì)胞激活和炎癥反應(yīng)發(fā)生的可能。五、發(fā)熱伴血小板減少綜合征內(nèi)皮細(xì)胞損傷的體外實(shí)驗(yàn)研究在體外內(nèi)皮細(xì)胞感染模型中,病毒感染可直接引起血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表面激活分子表達(dá)增強(qiáng)、細(xì)胞因子分泌增加、細(xì)胞活性下降、細(xì)胞跨膜電阻下降和大分子通過(guò)率上升、細(xì)胞連接蛋白和骨架蛋白表達(dá)改變等多方面變化。研究結(jié)論研究發(fā)現(xiàn)精氨酸代謝異常是發(fā)熱伴血小板減少綜合征中重要的致病特征,并因精氨酸具有免疫調(diào)控,血小板抑制和血管內(nèi)皮穩(wěn)定性調(diào)節(jié)等多方面的生物學(xué)作用,而與發(fā)熱伴血小板綜合征中的各個(gè)關(guān)鍵性臨床病理變化密切相關(guān)。精氨酸及其相關(guān)代謝物具有作為預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物和輔助治療藥物的潛力。研究意義與創(chuàng)新性發(fā)熱伴血小板減少綜合征是一種高發(fā)于中國(guó)內(nèi)陸省份并在全球多地均有報(bào)道的新發(fā)致死性傳染病,且因蜱蟲(chóng)的分布導(dǎo)致該疾病的易感人群多為偏遠(yuǎn)山區(qū)的農(nóng)村人口,而近十年來(lái)該疾病的持續(xù)流行給我國(guó)的醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān),并不斷威脅著全球的公共衛(wèi)生安全。但是該疾病既無(wú)有效的治療手段和疫苗,對(duì)它的發(fā)病機(jī)理也缺乏清晰的認(rèn)識(shí)。本研究首次從代謝角度出發(fā)對(duì)發(fā)熱伴血小板減少綜合征這一新發(fā)病毒性傳染病進(jìn)行了系統(tǒng)性分析,發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了發(fā)熱伴血小板減少綜合征中精氨酸代謝異常的特征性變化及其相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)。為該疾病的預(yù)后判斷,發(fā)病機(jī)制,臨床治療帶來(lái)了全新的視角;并且拓寬了精氨酸在急性病毒性傳染病中的認(rèn)識(shí)和應(yīng)用。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R512.8;R181.3
【圖文】：

第 13 頁(yè)圖 1 血清代謝組學(xué)研究技術(shù)路線圖2.2.2.3 哨點(diǎn)醫(yī)院的選擇及病例對(duì)照的納入標(biāo)準(zhǔn)SFTS 病例選擇來(lái)源于解放軍第一五四醫(yī)院的 SFTS 新發(fā)住院病例。信陽(yáng)市是河南省 SFTS 高發(fā)區(qū)，一五四醫(yī)院為河南省 SFTS 定點(diǎn)診治醫(yī)院。自從 2010年 10 月國(guó)家對(duì)發(fā)熱伴血小板減少綜合征開(kāi)展監(jiān)測(cè)以來(lái)，該院收治了近 5000 例SFTS 患者，占信陽(yáng)市 SFTS 病例的 82%。本研究以該醫(yī)院為哨點(diǎn)醫(yī)院，開(kāi)展 SFTS的病例納入及標(biāo)本收集。納入標(biāo)準(zhǔn):1.臨床診斷：診斷標(biāo)準(zhǔn)按照國(guó)家衛(wèi)生部頒發(fā)的《發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南》執(zhí)行；2.病原學(xué)診斷：SFTSV 病毒核酸檢測(cè)陽(yáng)性；3.年齡在 18-80 歲之間，男女不限。

圖2兩組獨(dú)立樣本的血清代謝物PCA分析

圖 3 兩組獨(dú)立樣本的血清代謝物 OPLS-DA 分析過(guò)對(duì)兩組研究人群總體代謝組物的 PCA 分析和 OPLS 分析，發(fā)差異能夠很好的將各組人群區(qū)分開(kāi)來(lái)，包括將 SFTS 病例與健康例區(qū)分以及死亡病例與生存病例的區(qū)分(圖 2，圖 3)。同時(shí)在對(duì)進(jìn)行校正，對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換及標(biāo)準(zhǔn)化后，采用歐式距離（Euclidean）的和平均值（Average）的聚類算法對(duì)代謝物的變化趨勢(shì)進(jìn)行了層繪制出代謝物的變化趨勢(shì)的熱圖（圖 4，圖 5）。發(fā)現(xiàn)不僅各組在聚集性，且某些代謝物之間因?yàn)樽兓厔?shì)相近也形成了明顯的ers）。

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