【摘要】：研究背景全球大多數(shù)的(70%至90%)原發(fā)性肝癌是肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC),在全球常見癌癥中排名第五位,在與癌癥相關(guān)的死亡原因中排名第二位,主要與乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)或丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)的慢性感染有關(guān)。HBV或HCV的慢性感染在低、中等收入國家更為普遍,據(jù)估計中國占全世界肝癌病例和死亡的50%。據(jù)統(tǒng)計,2005年中國肝癌死亡人數(shù)為339,308人,其中男性為246,808人,女性為92,500人,肝癌病例數(shù)估計為370,236人,其中男性為274,562人,女性為95,674人。雖然肝癌的診療水平較前提高,但超過一半的肝癌患者在確診后12個月內(nèi)死亡,不到6%的患者平均存活率為5年。因此,及早地診斷及治療肝癌是必要的。目前,肝癌的診斷與篩查的主要手段包括血清學(xué)檢查及影像學(xué)檢查,如甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)、超聲(Ultrasound,US)、計算機斷層掃描(Computed tomography,CT)及磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)。AFP是目前臨床上最常使用的血清學(xué)篩查指標(biāo)。但已有研究表明,AFP并不具備足夠的敏感性及特異性。AFP在孕期可以升高,并且已經(jīng)報道了在性腺腫瘤(生殖細胞和非生殖細胞)及其他惡性腫瘤存在異常升高。還有一些研究報道,在不患有肝癌的慢性肝病患者和急、慢性病毒性肝炎患者中存在血清AFP的異常升高。盡管AFP值大于400 ng/ml被用于肝癌的診斷,但僅在一小部分肝癌患者中會出現(xiàn)這種高水平的AFP。AFP在鑒別肝癌與良性肝病中的效用也被認(rèn)為受到高假陰性率和假陽性率的限制。由于肝癌在超聲上有不同的反射方式,因此14項評估監(jiān)測超聲的研究中報道超聲具有較低的敏感性。CT具有輻射暴露和相對低的軟組織對比度。MRI更耗時,更容易產(chǎn)生偽影,并且需要更多的專業(yè)知識來分析解釋圖像,可用性較低。肝癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為肝臟活檢及病理學(xué)分析,但肝臟活檢為侵襲性檢查,具有一定的創(chuàng)傷性。因此,尋找新的非侵襲性的生物標(biāo)志物來用于檢測早期的肝細胞癌是非常有必要的。自然殺傷細胞受體組2D(Natural killer cell receptor group 2D,NKG2D)是先天免疫系統(tǒng)中一種非常重要的活化受體。它對靶細胞的殺傷作用是通過識別靶細胞表面的配體、傳遞激活信號并激活免疫系統(tǒng)來實現(xiàn)的。NKG2D在腫瘤的免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。它在腫瘤發(fā)生的早期階段就會啟動先天免疫監(jiān)視和清除的功能。已經(jīng)有研究表明,在腫瘤患者的外周血中,NKG2D受體的表達水平明顯下降�，F(xiàn)在人們普遍認(rèn)為癌癥是由遺傳和表觀遺傳改變或功能障礙的綜合作用引起的。雖然癌癥發(fā)生的根本原因仍然很難明確,但是環(huán)境因素能夠改變表觀基因組并最終增加患癌癥的風(fēng)險。DNA甲基化是表觀遺傳改變中最常見的方式,我們推測其參與NKG2D基因的調(diào)控。研究目的檢測HCC患者、慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者及健康對照者(Healthy controls,HCs)的外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中NKG2D啟動子甲基化水平的差異,從而探究其在HCC中的診斷價值。研究方法本研究納入了 101例HCC患者,56例CHB患者及32例HCs。采集研究對象的外周血,提取外周血中的單個核細胞,從單個核細胞中提取DNA及RNA,對DNA進行甲基化修飾,對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。我們通過甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Methylation-specific polymerase chain reaction,MSP)探究NKG2D啟動子甲基化狀態(tài),通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測mRNA表達水平。結(jié)果1.三組基本臨床特征的比較:HCC患者組、CHB患者組、HCs組在年齡、性別上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),在ALT、AST、TBIL、ALB、Cr上均有明顯差異(P均0.001)。HCC患者組、CHB患者組HBsAg、HBV DNA、INR、PTA、AFP無明顯差異(P0.05),HBeAg差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。2.HCC患者中NKG2D啟動子的甲基化頻率(63/101,62.4%)明顯高于CHB患者(10/56,17.9%;X2=28.701,P0.001)和HCs(0/32,0.0%;X2=37.925,P0.001)。。CHB患者NKG2D啟動子甲基化頻率也高于HCs(X2=6.447,P=0.011)。3.在HCC患者中,NKG2D啟動子甲基化組與非甲基化組的TNM分期有統(tǒng)計學(xué)差異(X2=5.477,P=0.019),兩組的年齡(Z=-0.232,P=0.817)、性別(X2=0.926,P=0.336)、吸煙(X2=0.404,P=0.525)、飲酒(X2=0.701,P=0.402)、HBsAg(Z=-1.609,P=0.108)、HBeAg(X2=1.311,P=0.252)、HBV DNA(X2=0.029,P=0.865)、ALT(Z=-1.459,P=0.145)、AST(Z=-0.519,P=0.604)、TBIL(Z=-0.638,P=0.524)、ALB(Z=-1.911,P=0.056)、、INR(Z=-0.224,P=0.822)、、PTA(Z=-0.004,P=0.997)、Cr(Z=-1.893,P=0.058)、AFP(Z=-0.175,P=0.861)、腫瘤大小(X2=1.473,P=0.225)、腫瘤數(shù)量(X2=0.019,P=0.890)、血管侵襲(X2=0.901,P=0.342)、CTP分期(X2=0.936,P=0.626)、組織學(xué)分級(X2=3.520,P=0.172)無明顯差異。此外,以年齡、性別、HBsAg、HBeAg、HBV DNA、ALT、AST、TBIL、ALB、INR、PTA、Cr、AFP、腫瘤數(shù)量、有無血管侵襲、腫瘤大小、TNM分期作為自變量,以NKG2D啟動子是否甲基化作為因變量,進行多變量Logistic回歸分析,結(jié)果顯示TNM分期增加NKG2D啟動子甲基化。4.HCC患者的NKG2D mRNA水平顯著低于CHB患者(Z=-5.015,PP0.001)和HCs(Z=-8.296,P0.001)。CHB患者的NKG2D mRNA水平與HCs組的NKG2D mRNA水平差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-6.900,P0.001)。此外,HCC患者甲基化組的NKG2D mRNA水平低于非甲基化組NKG2D mRNA水平(Z=-2.236,P=0.025)。HCC患者中NKG2D啟動子甲基化狀態(tài)與NKG2D mRNA水平呈負相關(guān)(r=-0.224,P=0.025)。HCC患者HBeAg(+)組與HBeAg(-)組NKG2D mRNA水平無明顯差異(Z=-1.472,P=0.141),HBV DNA(+)組NKG2D mRNA表達水平低于HBV DNA(-)組(Z=-2.243,P=0.025),TNM分期(Ⅲ/Ⅳ)組NKG2D mRNA表達水平低于TNM分期(Ⅰ/Ⅱ)組(Z=-3.404,P=0.001),血管侵襲(+)組NKG2D mRNA表達水平低于血管侵襲(-)組(Z=-2.302,P=0.021)。HCC患者中NKG2D mRNA水平與AFP(r=-0.294,P=0.003)、TBIL(r=-0.207,P=0.037)、AST(r=-0.224,P=0.024)、TNM分期(r=-0.340,P0.001)、HBV DNA(r=-0.224,P=0.024)、血管侵襲(r=-0.230,P=0.021)具有相關(guān)性,與ALT(r=-0.164,P=0.102)、HBsAg(r=0.015,P=0.884)、INR(r=0.121,P=0.228)、PTA(r=0.127,P=0.204)、ALB(r=0.147,P=0.141)無相關(guān)性。5.NKG2D啟動子甲基化對區(qū)分HCC和CHB的敏感性為62.4%,特異性為82.1%,陽性預(yù)測價值為86.3%,陰性預(yù)測價值為54.8%。AFP對區(qū)分HCC和CHB的敏感性為48.5%,特異性為50.0%,陽性預(yù)測價值為63.6%,陰性預(yù)測價值為35.0%。當(dāng)AFP與NKG2D啟動子甲基化聯(lián)合,區(qū)分HCC和CHB的敏感性為81.2%,特異性為48.2%,陽性預(yù)測價值為73.9%,陰性預(yù)測價值為58.7%。在HCC診斷中,與單獨的AFP相比,AFP與NKG2D啟動子甲基化聯(lián)合具有更高的敏感性(X2=23.651,P0.001)及陰性預(yù)測價值(X2=6.667,P=0.010),在特異性(X2=0.036,P=0.850)及陽性預(yù)測價值(X2=2.255,P=0.133)上差異無統(tǒng)計學(xué)意義。當(dāng)AFP大于或等于20 ng/ml時,NKG2D啟動子甲基化組中的HCC檢出率(30/39,76.9%)明顯高于未甲基化組(19/38,50.0%;X2=6.029,P=0.014)。當(dāng)AFP小于20 ng/ml時,甲基化組中HCC的檢出率(33/34,97.1%)也高于未甲基化組(19/46,41.3%;X2=26.713,P0.001)。區(qū)分HCC和CHB的NKG2D啟動子甲基化的受試者工作特征曲線下面積(Area under the receiver operating characteristic curves,AUC)為 0.723(SE 0.0354,95%CI 0.646-0.791),明顯高于AFP水平的AUC(AUC 0.569,SE 0.0477,95%CI 0.488-0.648),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0037)。兩種標(biāo)志物的組合的AUC(AUC 0.647,SE 0.0389,95%CI 0.567-0.722)也高于單獨的AFP水平的AUC(AUC 0.569,SE 0.0477,95%CI 0.488-0.648;P=0.0141)。結(jié)論1.HCC患者中NKG2D啟動子存在異常甲基化,并且其甲基化水平明顯高于CHB患者及HCs,mRNA表達水平顯著低于CHB患者及HCs,這提示NKG2D啟動子高甲基化可能是導(dǎo)致基因表達水平下調(diào)的原因。2.在HCC患者中,NKG2D啟動子甲基化組與非甲基化組的TNM分期有統(tǒng)計學(xué)差異,并且TNM分期增加NKG2D啟動子甲基化。TNM分期是評估肝癌進展的重要指標(biāo),提示NKG2D啟動子甲基化可能與肝癌進展有關(guān)。HCC mRNA表達水平與HBV DNA、TNM分期、血管侵襲、AFP、TBIL和AST呈明顯負相關(guān)。這些指標(biāo)可反映病變嚴(yán)重程度,提示NKG2D啟動子甲基化可能與病變嚴(yán)重程度有關(guān)。3.NKG2D啟動子甲基化在肝癌中有良好的預(yù)測價值,這提示我們NKG2D啟動子甲基化可作為肝癌診斷的非侵入性標(biāo)志物,并且為肝癌的診斷和治療提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R735.7;R512.62

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本文編號：2789601