【摘要】：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌所誘發(fā)的單一病原體致死率最高的傳染性疾病之一,嚴(yán)重危害人類生命健康和社會公共安全。結(jié)核分枝桿菌可以入侵到機(jī)體的多個(gè)系統(tǒng)和器官中,引發(fā)不同部位的結(jié)核病。巨噬細(xì)胞處于機(jī)體免疫防御的第一線,在抵御外源微生物入侵中發(fā)揮重要作用。在各種微環(huán)境信號作用下,活化的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為差異化的功能表型,在早期感染中以促炎和微生物殺傷型的M1巨噬細(xì)胞為主,隨感染進(jìn)入后期,巨噬細(xì)胞多極化為M2型,對細(xì)菌的炎性損傷和控制力減弱,造成細(xì)菌胞內(nèi)復(fù)制和感染持續(xù)。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌HBHA和ESAT-6能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞功能的活化狀態(tài),影響結(jié)核分枝桿菌的感染進(jìn)程和結(jié)局。本課題著重于闡明HBHA和ESAT-6對巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的影響。第一部分方法:首先構(gòu)建IL-10啟動子雙熒光素酶報(bào)告載體,檢測重組載體轉(zhuǎn)染Raw264.7細(xì)胞后螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性比值,鑒定重組載體的表達(dá)活性。SDS-PAGE和Western blot分析和鑒定His GraviTrap柱純化的原核表達(dá)蛋白ESAT-6后,用HBHA和ESAT-6分別處理pGL3-IL10 promoter重組載體和pRLSV40內(nèi)參載體同時(shí)轉(zhuǎn)染的Raw264.7細(xì)胞,檢測各處理組的熒光素酶活性比值。結(jié)果:IL-10啟動子雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建成功,重組載體轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性比值比陽性對照pGL3-promoter組低(P0.01),但相對陰性對照pGL3-basic組表達(dá)明顯升高(P0.01)。ESAT-6蛋白以可溶形式表達(dá),特異性ESAT-6抗體檢測到與理論分子量大小相符的蛋白條帶。HBHA和ESAT-6處理組的熒光素酶活性比值與對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示HBHA和ESAT-6可能不具有刺激IL10啟動子活性的作用。第二部分方法:對小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDM)、Raw264.7細(xì)胞和THP-1細(xì)胞分別施加LPS+IFN-γ、IL-4、不同濃度的HBHA和ESAT-6蛋白。以ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-6、IL-12和TNFα。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測M1型極化分子標(biāo)志iNOS、TNFα和CXCL-10,以及M2型極化分子標(biāo)志Arg-1、CD206和CCL-22。Western blot檢測細(xì)胞iNOS和Arg-1蛋白表達(dá)水平。最后通過噬菌體介導(dǎo),構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌HBHA編碼基因Rv0475敲除的H37Rv-ΔRv0475菌株;以pMV261-Rv0475重組載體轉(zhuǎn)化Rv0475基因敲除株,構(gòu)建HBHA回補(bǔ)株H37Rv-c-Rv0475。用結(jié)核分枝桿菌H37Rv野生株及Rv0475基因敲除及回補(bǔ)菌株分別感染Raw264.7細(xì)胞,Western blot檢測細(xì)胞iNOS和Bcl-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:結(jié)核分枝桿菌HBHA處理BMDM細(xì)胞后,培養(yǎng)上清中IL6、IL-12、TNFα表達(dá)量明顯增加,iNOS和TNFα基因表達(dá)升高。處理后的Raw264.7細(xì)胞中IL-6分泌量增多,TNFα表達(dá)上調(diào),THP-1細(xì)胞中CXCL-10基因表達(dá)水平升高,與ESAT-6對巨噬細(xì)胞的作用結(jié)果一致。HBHA和ESAT-6處理BMDM細(xì)胞不能增加M2極化分子標(biāo)志Arg-1的蛋白表達(dá),但都能誘導(dǎo)BMDM細(xì)胞和Raw264.7細(xì)胞iNOS生成增加。與野生株感染組相比,結(jié)核分枝桿菌H37Rv-ΔRv0475菌株感染Raw264.7細(xì)胞后,iNOS蛋白表達(dá)水平降低。這都證明了HBHA和ESAT-6具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化的作用。第三部分方法:對透析后的HBHA蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記,Dot blot定性評價(jià)熒光標(biāo)記效率,再以HuProt?人蛋白質(zhì)組芯片篩選與HBHA互相作用的靶蛋白。然后構(gòu)建pGEX-5X-1/HBHA表達(dá)質(zhì)粒,誘導(dǎo)原核表達(dá)HBHA蛋白,GST pull down進(jìn)一步驗(yàn)證Raw264.7細(xì)胞蛋白組分ECSIT,Oncostatin M,PLEKHA8與HBHA相互作用。結(jié)果:人蛋白質(zhì)組芯片篩選出41個(gè)陽性信號點(diǎn)。GST pull down證實(shí)HBHA與Raw264.7細(xì)胞蛋白組分ECSIT,Oncostatin M,PLEKHA8均可發(fā)生相互作用。結(jié)論:結(jié)核分枝桿菌HBHA和ESAT-6可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1極化,介導(dǎo)HBHA發(fā)揮功能的巨噬細(xì)胞蛋白可能是ECSIT,Oncostatin M和PLEKHA8。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R52
【圖文】：

圖 1 結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞內(nèi)生態(tài)位[52]腫微環(huán)境體種植于肺部，細(xì)菌和宿主因素相互作用誘導(dǎo)組織重塑，造成稱為肉芽腫。過去十年研究結(jié)果表明，MTB 有助于增強(qiáng)肉芽腫利用這些結(jié)構(gòu)來復(fù)制和傳播[53]。當(dāng) MTB 進(jìn)入宿主體內(nèi)時(shí)，其首 通過宿主 CCL2 來募集巨噬細(xì)胞，然后巨噬細(xì)胞攜帶 MTB 穿

同類型巨噬細(xì)胞活化刺激因子與細(xì)胞內(nèi)信號通路網(wǎng)交互作用，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)出相反或協(xié)同的功能狀態(tài)，最終調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境趨向于穩(wěn)態(tài)。圖2 巨噬細(xì)胞極化的刺激物及信號通路[91]活化的M1型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出巨噬細(xì)胞抗原提呈能力增強(qiáng)[92]，清除細(xì)菌，病毒或真菌感染以及抗腫瘤的能力均增加。它可以分泌一系列炎性因子如IL-1β、IL-12、IL-6、IFN-γ、TNFα和趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11等，并高表達(dá)iNOS并隨之生成NO，釋放蛋白水解酶和抗菌肽，增強(qiáng)吞噬作用，以及形成微生物吞噬體與富含水解酶的酸性溶酶體的融合[93]。TNF-α可以募集免疫細(xì)胞到感染位點(diǎn)并形成肉芽腫，同時(shí)有助于維持小鼠慢性感染期間肉芽腫的結(jié)構(gòu)完整性。另有研究發(fā)現(xiàn)，使用抗結(jié)核藥物治療感染MTB的TNF-α缺陷小鼠，使其肺部細(xì)菌載量降低到不可檢測的程度，但發(fā)現(xiàn)該小鼠肺、脾和肝中重新出現(xiàn)高載量的細(xì)菌感染，并且動物在13至18周內(nèi)死亡[94]

空軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ ）表示，用統(tǒng)計(jì)因素方差分析，認(rèn)為 P<0.05 差異子雙熒光素酶報(bào)告載體擴(kuò)增結(jié)果性引物以 PCR 方法擴(kuò)增目的片段一條明亮的電泳條帶，片段大小與

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 付威;姜英;王婷玉;張赫;董佳琦;萬朋;;巨噬細(xì)胞極化與腫瘤的研究進(jìn)展[J];吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào);2019年02期

2 巢汝;黃靚;屈順林;張弛;;巨噬細(xì)胞能量代謝與動脈粥樣硬化[J];生命的化學(xué);2018年03期

3 崔凡;穰真;王有為;楊戈;;AIDS患者巨噬細(xì)胞對白念珠菌的吞噬和滅活功能研究[J];中國麻風(fēng)皮膚病雜志;2017年04期

4 孟董超;王東;宋娟;盧彥珍;;巨噬細(xì)胞極化在冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用研究進(jìn)展[J];長治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2017年02期

5 李雪巖;楊玉玉;陳君;;中藥抗巨噬細(xì)胞泡沫化的研究進(jìn)展[J];藥學(xué)與臨床研究;2017年05期

6 袁鋒;尚茹茹;張錦;溫婷;李愛萍;劉曉紅;;巨噬細(xì)胞極化與動脈粥樣硬化[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2015年22期

7 高雙英;吳靜;楊貴麗;;結(jié)腸癌腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的浸潤和MMP-2的表達(dá)、血管生成關(guān)系的研究[J];中國免疫學(xué)雜志;2016年03期

8 龔立博;索艷榮;王學(xué)嶺;郭茂娟;;基于巨噬細(xì)胞亞型分化探討中醫(yī)藥防治動脈粥樣硬化的研究進(jìn)展囿[J];中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志;2016年05期

9 侯亮;路英進(jìn);丁彥春;;養(yǎng)心氏對巨噬細(xì)胞極化及活化的調(diào)節(jié)[J];中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志;2016年15期

10 趙清杰;朱琳楠;丁文軍;趙勇;;巨噬細(xì)胞極化與細(xì)胞代謝的相互調(diào)控[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2015年03期

相關(guān)會議論文 前10條

1 姚芳苡;黃自坤;傅穎媛;;人巨噬細(xì)胞極化相關(guān)長鏈非編碼RNA表達(dá)譜篩選及研究[A];第十二屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會摘要匯編[C];2017年

2 李枋;霏李杰;;扶正解毒方對共培養(yǎng)體系下腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型變化影響的實(shí)驗(yàn)研究[A];第一屆青年中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學(xué)術(shù)論壇論文集[C];2015年

3 白力;張文蘭;竇晶莉;王永福;;組蛋白修飾與巨噬細(xì)胞極化的關(guān)系[A];第十屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會匯編[C];2015年

4 史玉玲;王又明;豐美福;;巨噬細(xì)胞激活作用的研究[A];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會第五次會議論文摘要匯編[C];1992年

5 程相朝;毛福超;廖成水;;巨噬細(xì)胞極化形成的影響因素研究進(jìn)展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物微生態(tài)學(xué)分會第五屆第十三次全國學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2018年

6 曾嬌;;巨噬細(xì)胞極化對炎癥性疾病的影響[A];第十三屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會摘要匯編[C];2018年

7 李小鵬;張倫理;;巨噬細(xì)胞極化現(xiàn)象與結(jié)核病的關(guān)系[A];中華醫(yī)學(xué)會2014全國微生物學(xué)與免疫學(xué)學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2014年

8 陳羅泉;萬曉朋;韓泉;王青青;;白細(xì)胞介素27在巨噬細(xì)胞抗病毒天然免疫應(yīng)答中的作用研究[A];浙江省免疫學(xué)會第十次學(xué)術(shù)大會論文集[C];2016年

9 馬曉媛;田李星;靳賀;梁華平;;創(chuàng)傷/燒傷后單核—巨噬細(xì)胞變化及調(diào)節(jié)措施研究進(jìn)展[A];2015第十一屆全國中西醫(yī)結(jié)合災(zāi)害醫(yī)學(xué)大會、江蘇省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會第二屆災(zāi)害醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議、中華衛(wèi)生應(yīng)急電子雜志第二屆編委會會議暨2015江蘇國際醫(yī)療器械科技博覽會學(xué)術(shù)論文集[C];2015年

10 馬翠卿;胡光磊;尹曉琳;胡潔;楊建嶺;王秀榮;魏林;;A族鏈球菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞壞死而非凋亡[A];河北省免疫學(xué)會第六次免疫學(xué)大會資料匯編[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 主持人 王建新;巨噬細(xì)胞的多面人生[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2015年

2 通訊員 李靜 記者 胡德榮;惡性腫瘤巨噬細(xì)胞未必皆“惡人”[N];健康報(bào);2014年

3 張化;新技術(shù)有望延長血小板保存期[N];中國醫(yī)藥報(bào);2003年

4 張化;半乳糖可延長血小板保存期[N];中國醫(yī)藥報(bào);2003年

5 蘭克;以嘗試用巨噬細(xì)胞治癱瘓[N];科技日報(bào);2000年

6 記者 張家偉;巨噬細(xì)胞水平影響血壓高低[N];健康報(bào);2019年

7 記者 房琳琳;“別吃我”! 癌細(xì)胞還有第二種方式對巨噬細(xì)胞這樣說[N];科技日報(bào);2017年

8 本報(bào)記者 張曄 通訊員 蔡心軼 張翰文;肥胖傷肝？原來是巨噬細(xì)胞在作怪[N];科技日報(bào);2016年

9 唐穎 倪兵 陳代杰;巨噬細(xì)胞泡沫化抑制劑研究快步進(jìn)行[N];中國醫(yī)藥報(bào);2006年

10 侯嘉 何新鄉(xiāng);硒的神奇功能[N];中國食品質(zhì)量報(bào);2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張棟梁;CD226/TIGIT-CD155信號調(diào)控巨噬細(xì)胞極化在同種異體移植排斥中的作用[D];中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

2 李冰;Kallistatin調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化炎癥及構(gòu)建靶向巨噬細(xì)胞黑色素納米探針的研究[D];東南大學(xué);2018年

3 郭銀鳳;巨噬細(xì)胞對糖尿病腎病足細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制研究[D];東南大學(xué);2018年

4 李華;結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究及快生菌構(gòu)建探索[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

5 范婷婷;TIPE2調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞胸腺外遷及M2巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制研究[D];中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院);2018年

6 成雪;酪蛋白糖肽抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 邵柏棕;巨噬細(xì)胞β-arrestin-1在動脈粥樣硬化和多發(fā)性硬化中的作用及機(jī)制研究[D];中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

8 施翔翔;巨噬細(xì)胞CCL20和IL-17的調(diào)控機(jī)制及其與冠心病的關(guān)系研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

9 朱啟金;高糖刺激巨噬細(xì)胞源外泌體對腎小球系膜細(xì)胞的作用及機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

10 呂丹;緩釋Ⅵ型膠原誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)缺損再生的應(yīng)用研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 吳陽陽;小檗堿對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2015年

2 吳偉君;外泌體調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能在腎臟炎癥中的作用研究[D];東南大學(xué);2018年

3 金敬一;CD226分子影響巨噬細(xì)胞極化在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎中的作用和初步機(jī)制[D];中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

4 楊佩穎;腫瘤細(xì)胞釋放自噬小體誘導(dǎo)小鼠中性粒細(xì)胞CCL2產(chǎn)生及其影響巨噬細(xì)胞趨化的實(shí)驗(yàn)研究[D];東南大學(xué);2018年

5 周博;ECDI—凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠異體復(fù)合組織移植耐受機(jī)制的研究[D];中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

6 安冬潔;去泛素化酶CYLD相互作用蛋白驗(yàn)證及其調(diào)控巨噬細(xì)胞活化和功能的機(jī)制研究[D];中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

7 殷園;年齡對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化和功能的影響[D];中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

8 毛凱瓊;大黃魚IL-4/13A和IL-4/13B的分子特征及其在單核/巨噬細(xì)胞中的功能研究[D];廈門大學(xué);2017年

9 翟東f;RNA結(jié)合蛋白QKI調(diào)控單核巨噬細(xì)胞極化及抗感染機(jī)制研究[D];中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

10 周麗娜;牙周炎癥狀態(tài)與牙齦組織中巨噬細(xì)胞極化和功能的相關(guān)性研究[D];中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué);2018年

本文編號：2745828