【摘要】：目的:探討巨噬細胞外泌體對HBV復制的可能機制及與慢性乙型肝炎患者HBV DNA的相關性分析。方法:(1)體外誘導、鑒定單核巨噬細胞及其分泌的外泌體,并將單核巨噬細胞外泌體與HepG2.2.15細胞共培養(yǎng),利用實時定量PCR檢測共培養(yǎng)后細胞上清中HBV DNA的變化情況;(2)分析檢測單核巨噬細胞外泌體中功能性微小RNA(microRNA,miRNA)的表達變化;(3)分別利用miRNA模擬物轉(zhuǎn)染和阻斷試驗,驗證篩選功能性miRNAs對HBV DNA抑制效應;(4)結合臨床研究隊列,分別入組慢乙肝免疫活化期(immune activation,IA)、低復制期(inactive carrier,IC)患者,同時健康供者(healthy control,HC)作為對照組,檢測上述患者血清外泌體中功能性miRNAs分子的表達情況,并與慢性乙肝患者HBV復制水平做相關性分析,確定血清外泌體中功能性miRNAs分子變化的臨床意義;(5)利用體外研究,驗證不同免疫狀態(tài)下患者外周血CD14陽性巨噬細胞及血清外泌體對HepG2.2.15細胞HBV復制的影響。結果:(1)巨噬細胞外泌體抑制HBV復制;(2)巨噬細胞外泌體中miRNA-4284和miRNA-1260a的表達水平明顯升高;(3)miRNA-4284和miRNA-1260a可以抑制HBV復制;(4)IC期患者血清外泌體中miRNA-4284和miRNA-1260a的表達均較IA期高;(5)IA期患者血清外泌體中miRNA-4284和miRNA-1260a的表達與患者HBV DNA載量呈負相關;(6)IC期患者血清及巨噬細胞外泌體對HBV抑制效果均明顯強于IA期患者。結論:(1)體外,巨噬細胞外泌體抑制HBV復制可能是通過miRNA-4284和miRNA-1260a這兩個效應分子發(fā)揮作用;(2)IC期患者血清外泌體中miRNA-4284和miRNA-1260a的表達較IA期高;(3)IC期患者血清外泌體及巨噬細胞外泌體抑制HBV DNA效果明顯強于IA期患者。
【圖文】：

將貼壁的單核巨噬細胞用胰酶消化后通過流式染色如圖1B 所示，高表達巨噬細胞 CD11b-FITC 和 CD14-percp-cy5.5 表面標志物，其陽性率分別為 82.8%、66.4%；同時高表達 M1 型單核巨噬細胞表面標志物 CD282-PE，陽性率為 94.6%；但是，低表達 M2 型單核巨噬細胞表面標志物 CD163-PE，陽性率為 0.19%。由此可見，經(jīng) PMA 誘導 24h 后，屬于 M1 型單核巨噬細胞。（誘導出的單核巨噬細胞備用）圖 1 單核巨噬細胞形態(tài)和流式鑒定A.THP-1 細胞經(jīng) PMA 誘導前、后形態(tài)學觀察; B. THP-1 細胞誘導為單核巨噬細胞的流式學鑒定2.體外

細胞術檢測外泌體的表面標志：將提取出的單核巨噬細胞來源外泌式細胞術方法檢測外泌體的特征性表面標志物 CD9-percp-v81-percp-vio700 的 表 達 ， 如 圖 2B 所 示 ， 提 取 出 外 泌 體 9-percp-vio700 和 CD81-percp-vio700,其陽性率分別為 42.2%和 40.7，，我們提取出的沉淀表達外泌體特有的表面標志物 CD9 和 CD81。
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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1 楊小平;楊雅芳;董建國;王志剛;劉艷萍;趙鐵軍;;恩替卡韋和阿德福韋酯分別治療e抗原陽性初治慢性乙肝近期療效分析[A];第6屆全國疑難及重癥肝病大會論文集[C];2011年

本文編號：2662568