【摘要】：目的探討NAs治療后cccDNA轉(zhuǎn)錄活性與HBV pgRNA、DNA和HBsAg的動(dòng)力學(xué)關(guān)系,探索pgRNA作為cccDNA轉(zhuǎn)錄活性的新標(biāo)志物的可行性。方法建立體外TDF抗病毒HepG2.2.15細(xì)胞模型,于基線、抗病毒12d、24d和36d收集細(xì)胞及上清液;提取細(xì)胞內(nèi)總DNA,經(jīng)PSAD消化、滾環(huán)擴(kuò)增、跨缺口實(shí)時(shí)熒光PCR方法定量檢測HBV cccDNA水平,Alu-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)HBV S整合基因;應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR方法定量檢測細(xì)胞上清液HBV pgRNA和HBV DNA的水平;化學(xué)發(fā)光試劑檢測細(xì)胞上清液HBsAg水平。評價(jià)未抗病毒時(shí)HepG2.2.15細(xì)胞模型功能穩(wěn)定性;描繪TDF抗病毒后各標(biāo)志物的時(shí)間-含量曲線,分析隨治療時(shí)間的延長HBV pgRNA、HBsAg、HBV DNA及cccDNA水平變化趨勢。應(yīng)用雙變量相關(guān)性分析,分析各抗病毒后各檢測點(diǎn)上清液HBV pgRNA、HBsAg、HBV DNA變化與肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA變化的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果(1)未經(jīng)TDF抗病毒的HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA及上清液HBV DNA水平在基線最高,上清液HBsAg水平在培養(yǎng)12d達(dá)到分泌高峰;細(xì)胞內(nèi)cccDNA與上清液DNA、HBsAg水平在培養(yǎng)36d內(nèi)穩(wěn)定分泌(F=0.604、0.823、1.284,P均0.05);而HBV pgRNA在培養(yǎng)12d達(dá)分泌高峰,培養(yǎng)36d內(nèi)總體水平處于升高趨勢(F=8.140,P0.05)。(2)TDF抗病毒后HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA及上清液HBV pgRNA、HBV DNA、HBsAg總體水平均呈下降趨勢;HBV DNA最先低于檢測下限,其次是HBsAg;而pgRNA、cccDNA水平下降緩慢,36d兩者均未低于檢測值下限。(3)HepG2.2.15細(xì)胞基線及抗病毒24d均未檢測到HBV S整合基因。(4)TDF抗病毒后細(xì)胞內(nèi)cccDNA與上清液pgRNA總體下降趨勢一致,36d均未低于檢測值下限。從基線到抗病毒12d、12d到24d、24d到36d時(shí)段兩者變化幅度均呈完全正相關(guān)(r=1.000,p=0.000)。(5)TDF抗病毒后細(xì)胞內(nèi)cccDNA與上清液HBsAg、HBV DNA水平均呈下降趨勢,HBsAg和HBV DNA持續(xù)性下降于36d內(nèi)均低于檢測值下限,而cccDNA仍可檢測到低值陽性;基線到抗病毒12d、12d到24d、24d到36d三個(gè)時(shí)段,cccDNA變化幅度與HBsAg變化幅度均無相關(guān)性(r分別為0.213、-0.016、0.593,p均0.05),與DNA變化幅度也均無相關(guān)性(r分別為-0.638、0.550、0.644,p均0.05)。結(jié)論(1)外體TDF抗病毒HepG2.2.15細(xì)胞模型可用于反映NAs后cccDNA轉(zhuǎn)錄活性及轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)物消長關(guān)系。(2)pgRNA反映細(xì)胞內(nèi)cccDNA含量及轉(zhuǎn)錄活性優(yōu)于HBsAg和HBV DNA,在HBV DNA陰轉(zhuǎn)后有利于繼續(xù)監(jiān)測NAs抗病毒治療效果。(3)pgRNA檢測簡單無創(chuàng),作為NAs治療監(jiān)測cccDNA轉(zhuǎn)錄活性的指標(biāo)具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
【圖文】：

（8）旋渦混合器 ：海門市其林貝爾儀器制造有限公司。2.2.4 基礎(chǔ)儀器設(shè)備（1）微量移液器 ：德國 Eppe 法國吉爾森；（2）電子精密天平 ：上海衡平電子天平有限公司；（3）SIM-F140AY65 制冰機(jī)：上海巴玫實(shí)業(yè)有限公司；（4）自動(dòng)高壓蒸汽滅菌器 ：致微（廈門）儀器有限公司；（5）超純水器、-80℃、-20℃、4℃冰箱：美國賽默飛世爾科技公司。2.3 實(shí)驗(yàn)方法2.3.1 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線圖

NAs 治療后 cccDNA 轉(zhuǎn)錄活性與 HBV pgRNA、DNA 和 HBsAg 動(dòng)力學(xué)關(guān)系的體外研究 2015 級碩士研究生學(xué)位論文2.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)基本條件（1）細(xì)胞形態(tài)：人肝癌細(xì)胞 HepG2 和 HepG2.2.15 形態(tài) 致，顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁生長，呈抱團(tuán)樣堆積，，形態(tài)通透，呈多邊形或梭形，如圖 2-2。A B
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R512.62

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本文編號：2657213