【摘要】：目的建立巨細(xì)胞病毒特異性T淋巴細(xì)胞(cytomegalovirus specific T cells,CMV CTL)體外擴(kuò)增的方法,通過實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)G-CSF動員的供者外周血干細(xì)胞采集物來源的CMV CTL具有抗巨細(xì)胞病毒作用,為臨床開展過繼免疫療法治療巨細(xì)胞病毒感染提供新的依據(jù)。方法用1μg/mL全長巨細(xì)胞病毒PP65(CMV pp65)多肽體外多輪刺激由粒細(xì)胞-集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)動員的外周血干細(xì)胞采集物中分離的單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),同時加入白細(xì)胞介素2(interleukin 2,IL-2)、IL-15、IL-21擴(kuò)增20天。在培養(yǎng)第7天,加入絲裂霉素處理的負(fù)載CMV pp65抗原肽的自體PBMC,第10天補(bǔ)充經(jīng)γ射線輻照處理并負(fù)載CMV pp65抗原肽的PBMC和CD3(OKT3);對照組為未加入抗原肽進(jìn)行擴(kuò)增的PBMC組。采用多色流式細(xì)胞術(shù)分別對擴(kuò)增前、擴(kuò)增后的T淋巴細(xì)胞表型及細(xì)胞內(nèi)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)的分泌水平進(jìn)行分析,同時檢測CD107a脫顆粒殺傷功能,并通過ELISA檢測供者血清中CMV IgM/IgG抗體滴度水平。結(jié)果培養(yǎng)后可以收集得到(165.26±6.14)×10~6個細(xì)胞,其中CD3~+T細(xì)胞占89.21%,CD8~+T細(xì)胞占CD3~+T細(xì)胞的(43.54±28.03)%,CD4~+T細(xì)胞占CD3~+T細(xì)胞(34.23±26.18)%。獲得的CD3~+T細(xì)胞以效應(yīng)記憶性T細(xì)胞(effector memory T cells,T_(EM))為主,且擴(kuò)增培養(yǎng)后的CD8~+和CD4~+T_(EM)比例較培養(yǎng)前顯著增高。另外,培養(yǎng)后干細(xì)胞樣記憶性T細(xì)胞(stem cell-like memory T cells,T_(SCM))和組織原位記憶T細(xì)胞(tissue-resident memory T cells,T_(RM))的比例均較培養(yǎng)前顯著增加。在功能實(shí)驗(yàn)中,培養(yǎng)后得到的IFN-γ~+分泌型CMV特異性CD8~+T細(xì)胞群比例較擴(kuò)增前明顯增加,TNF-α~+CMV特異性CD8~+T細(xì)胞比例呈增長趨勢;能夠分別分泌IFN-γ和TNF-α的CMV特異性CD4~+T細(xì)胞群比例與培養(yǎng)前無明顯變化。培養(yǎng)后CD8~+CMV特異性T細(xì)胞的CD107a表達(dá)水平為(3.28±1.97)%,與培養(yǎng)前無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外,供者體內(nèi)CMV IgG水平與供者年齡呈現(xiàn)正相關(guān),且在該培養(yǎng)體系下,IFN-γ~+和TNF-α~+CMV特異性T細(xì)胞擴(kuò)增比例與供者年齡呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論本研究成功建立了在體外有效擴(kuò)增CMV CTL的方法,同時證明了由G-CSF動員的供者外周血干細(xì)胞采集物擴(kuò)增得到的CMV CTL具有抗巨細(xì)胞病毒作用。
【圖文】：

圖 1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化Figure 1 Morphological changes of CMV T cells 1st day of cultivation; B. The 6th day of cultivation; C. The 10th day of cultiThe 15th day of cultivation.

16圖 2 體外擴(kuò)增 T 細(xì)胞倍數(shù)變化Figure 2 Fold expansion of T cells in vitroA. Fold expansion of T cells in CMV pp65 antigen peptide added culture group; B. Fold
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R511

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本文編號：2638606