【摘要】：背景:孢子絲菌病(sporotrichosis)是由申克孢子絲菌復(fù)合體引起的慢性肉芽腫性真菌感染性疾病,多見于暴露部位,如面部、頸部及四肢等。孢子絲菌病可累及皮膚粘膜、皮下組織、局部淋巴結(jié)及深部臟器。申克孢子絲菌是一種雙相病原菌,存在形式為酵母態(tài)或菌絲態(tài)。全球范圍內(nèi)幾乎都存在孢子絲菌病的分布,此病病程長危害大。其臨床過程通常為:致病菌通過破損的皮膚或黏膜侵入,沿淋巴管移行,導(dǎo)致病變處皮下結(jié)節(jié)、化膿、破潰、滲出及肉芽腫等病變。還有極少數(shù)患者因吸入孢子絲菌而導(dǎo)致肺部孢子絲菌感染。對于免疫功能低下的個體,孢子絲菌病原菌可能經(jīng)血播散至中樞神經(jīng)及內(nèi)臟,引起全身系統(tǒng)性感染,可能危及生命。目前該病治療方法有限,主要由碘化鉀療法,抗真菌藥物等。此病治療時間較長,且因患病人群多為貧困山區(qū)人群,用藥不規(guī)律,易引起疾病遷延不愈,因此探究孢子絲菌病的免疫過程,因而找到針對此病的較有效的治療方法,非常重要。機體抵抗孢子絲菌的機制主要包括天然免疫和適應(yīng)性免疫。機體的天然屏障(完整的皮膚黏膜,有效抵抗外來抗原對機體的入侵)、免疫細(xì)胞和免疫因子構(gòu)成了天然免疫。巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及樹突狀細(xì)胞這三種固有免疫細(xì)胞是機體的固有免疫系統(tǒng)抵抗真菌的主要細(xì)胞成分;各種提高免疫細(xì)胞殺傷作用或直接作用于外來抗原的細(xì)胞因子、一氧化氮等稱為免疫因子,免疫因子同樣在機體抵抗真菌過程中發(fā)揮重要作用。天然免疫細(xì)胞因其強大的初期抵抗外來抗原入侵機體的特征,是抗孢子絲菌免疫的主力。孢子絲菌病皮損的病理學(xué)檢查中一般可見“三區(qū)”現(xiàn)象,三區(qū)現(xiàn)象中最內(nèi)層為大量中性粒細(xì)胞浸潤,因為中性粒細(xì)胞是感染最初期(24h內(nèi))最早產(chǎn)生效應(yīng)的固有免疫細(xì)胞。但是中性粒細(xì)胞對孢子絲菌殺傷力非常有限。而樹突狀細(xì)胞的主要功能是向淋巴細(xì)胞抗原提成,在整體固有免疫系統(tǒng)中殺滅孢子絲菌過程中發(fā)揮的作用較弱。在機體抗孢子絲菌免疫過程中,獲得性免疫同樣發(fā)揮了重要作用,支持這一觀點的重要的證據(jù)為:當(dāng)嚴(yán)重獲得性免疫缺陷的HIV感染者感染孢子絲菌病后,通常不再僅僅表現(xiàn)為皮膚型,而常常發(fā)展為播散型孢子絲菌病,且嚴(yán)重獲得性免疫缺陷患者感染播散型孢子絲菌病后,對各種治療方法均反應(yīng)不佳。巨噬細(xì)胞具有強大的吞噬殺傷能力和較強的抗原呈遞功能,是固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁,是機體抵抗孢子絲菌的核心。但被巨噬細(xì)胞吞噬的孢子絲菌,仍可部分保持結(jié)構(gòu)完整甚至出芽繁殖的能力,這反而成為孢子絲菌并免受其他免疫機制的攻擊并導(dǎo)致疾病遷延不愈的重要原因,因此探究如何提升巨噬細(xì)胞殺滅胞內(nèi)孢子絲菌的能力極為重要。以往的觀點認(rèn)為溫?zé)岑煼ǖ臋C制為殺滅病灶中的孢子絲菌,但也有研究指出短時間內(nèi)的41℃的溫?zé)釋︽咦咏z菌生長幾乎無影響。所以,局部溫?zé)嶂委熸咦咏z菌的機制還可能為溫?zé)崽岣邫C體抗孢子絲菌的免疫,從而促進真菌的殺滅。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫緊張可激活細(xì)胞膜上鈣離子通道,介導(dǎo)細(xì)胞外Ca~(2+)內(nèi)流,此過程稱為鈣庫操作性鈣離子通道(store-operated calcium entry,SOCE)。Orai1和STIM1是SOCE的兩個最主要的組成分子,Orai 1是位于胞內(nèi)細(xì)胞膜下的一種可構(gòu)成鈣離子通道的蛋白分子,STIM1則位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上,STIM1可以感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca~(2+)的含量的多少,當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子濃度降低,STIM 1可被激活從而導(dǎo)致Orai 1通道打開,Ca~(2+)內(nèi)流,調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理病理過程。由STIM1蛋白激活介導(dǎo)Orai1通道開放導(dǎo)致的細(xì)胞鈣內(nèi)流的通道稱為細(xì)胞儲量調(diào)控Ca~(2+)離子釋放激活Ca~(2+)離子(CRAC)通道。對于包括各種免疫細(xì)胞在內(nèi)的非興奮型細(xì)胞,鈣內(nèi)流的最主要方式是通過CRAC鈣通道的鈣內(nèi)流。CRAC鈣通道的關(guān)鍵啟動蛋白STIM1,因其掌管包括各種免疫細(xì)胞在內(nèi)的幾乎全部非興奮細(xì)胞的鈣離子通道開放與否,所以參與調(diào)控淋巴細(xì)胞,肥大細(xì)胞,吞噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的鈣通道開放,從而參與調(diào)控各免疫細(xì)胞的功能狀態(tài)。鈣離子內(nèi)流通常預(yù)示著免疫細(xì)胞的激活,當(dāng)外界抗原抗原刺激各種免疫細(xì)胞時,抗原表面的各型配體與免疫細(xì)胞表面的免疫受體、G蛋白耦聯(lián)受體等細(xì)胞膜表面迅速結(jié)合,導(dǎo)致磷脂酶C(PLC)活化,接著磷酯酰肌醇二磷酸(PIP2)水解,水解的PIP2可產(chǎn)生三磷酸肌醇(IP3),IP3與免疫細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3受體結(jié)合,從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca~(2+)通道開放使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca~(2+)外流至胞質(zhì)內(nèi),當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子濃度明顯降低后,Ca~(2+)與STIM1結(jié)合度降低使得Ca~(2+)從STIM1上解離,隨后STIM1被激活,激活后的STIM1達到細(xì)胞膜下,激活Orai1蛋白,Orai1形成了Orai1鈣離子通道,引發(fā)鈣離子內(nèi)流,并激活下游通路使免疫細(xì)胞活化。細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加是免疫細(xì)胞活化的重要標(biāo)志之一。近年來,有研究發(fā)現(xiàn),STIM1除了能感受細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化,其還是一種細(xì)胞外界物理刺激感受蛋白,可感受細(xì)胞內(nèi)的溫度變化,被細(xì)胞內(nèi)的溫度所激活,激活后的STIM1可同其他刺激激活過程一樣的開啟下游鈣通道,引起一系列下游基因變化。所以此過程可能是溫?zé)峄罨庖呒?xì)胞,達到治療孢子絲菌病的目的的機制之一。本實驗從人體孢子絲菌病標(biāo)本,細(xì)胞層面以及小鼠孢子絲菌病模型層面探討溫?zé)嶂委熸咦咏z菌病的機制,為今后擴大臨床應(yīng)用提供理論指導(dǎo)意義。材料與方法:1、實驗對象查找科室病理研究室病理檢查結(jié)果為孢子絲菌病的患者資料,將保存的皮損病理標(biāo)本蠟塊制成切片,進行免疫組化染色。細(xì)胞系選擇為小鼠巨噬細(xì)胞系A(chǔ)na-1作為研究對象。原代細(xì)胞為提取的小鼠的骨髓源性巨噬細(xì)胞及Naive CD4~+T細(xì)胞。小鼠孢子絲菌病模型為6-8周周齡、體重20±0.1g雌性小鼠。2、溫?zé)嶂委煼桨笢責(zé)嶂委煈?yīng)用的儀器是我們科室擁有專利的局部溫?zé)嶂委焹x,溫?zé)嶂委焹x治療原理為使溫?zé)崽筋^并不直接接觸患者皮損,而是在指定部位給予光照加熱,并使用紅外線監(jiān)測溫度,使加熱部位保持在設(shè)定溫度。溫?zé)嶂委煹脑O(shè)定溫度對于人體通常為44℃,小鼠為42℃。孢子絲菌病患者溫?zé)嶂委煼椒?前三次連續(xù)治療三天,每天一次;隔一周后連續(xù)治療兩天,每天一次;然后一周一次治療直到治愈。小鼠孢子絲菌病溫?zé)嶂委煼椒?前三次連續(xù)治療三天,每天一次;隔一周后連續(xù)治療兩天,每天一次;一周后治療一次。細(xì)胞溫?zé)?將細(xì)胞種于六孔板后過夜,將水浴鍋調(diào)至實驗設(shè)定溫度后,將六孔板放入水浴鍋中的水面溫?zé)崽幚?溫?zé)崽幚?0分鐘,溫?zé)崽幚斫Y(jié)束后將細(xì)胞重新放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3、免疫組化檢測相關(guān)蛋白將組織標(biāo)本蠟塊用冰凍切片機調(diào)至4μm厚度后切片,進行免疫組化實驗,檢測巨噬細(xì)胞M1標(biāo)志物CD86、巨噬細(xì)胞M2標(biāo)志物CD206表達。在20倍物鏡下隨機選取5個視野,計數(shù)視野內(nèi)CD206陽性與CD86陽性細(xì)胞的比值,并將比值取平均值。4、實時熒光定量PCR檢測各因子的表達采用實時熒光定量PCR方法檢測冰凍孢子絲菌病患者皮膚標(biāo)本中及細(xì)胞實驗的細(xì)胞中各因子的表達。提取總RNA時使用Qiagen提取試劑盒;RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA時使用PrimeScript RT regagent Kit,方法遵照說明書;將cDNA實時熒光定量PCR擴增SYBR Premis Ex Taq,方法遵照說明書,并采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法行相對定量的結(jié)果分析。5、MTS檢測溫?zé)峒?xì)胞增殖的影響檢測溫?zé)釋?xì)胞增殖的作用時使用MTS試劑。分別于第0天、1天、2天、3天和4天加入MTS后用酶標(biāo)儀檢測種于96孔板中細(xì)胞的增殖情況,酶標(biāo)儀設(shè)定為檢測490nm的吸光度值。利用吸光度值計算細(xì)胞增殖情況。6、熒光酶標(biāo)儀檢測胞內(nèi)鈣離子含量利用熒光酶標(biāo)儀,檢測溫?zé)岷蠹?xì)胞內(nèi)鈣離子的變化。將細(xì)胞種于96孔黑色酶標(biāo)板中,用Fluo-4 AM檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量較。7、流式細(xì)胞術(shù)檢測溫?zé)釋Φ蛲龅挠绊憸責(zé)釋?xì)胞凋亡的影響的檢測依靠流式細(xì)胞儀。做法為溫?zé)崽幚淼那耙惶鞂⒓?xì)胞接種于六孔板中,第二天根據(jù)設(shè)定的溫?zé)?在水浴鍋中溫?zé)崽幚砗?放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中重新培養(yǎng),24小時后使用FITC AnnexinⅤ凋亡試劑盒根據(jù)細(xì)胞的十字象限分布情況計算溫?zé)岷蠹?xì)胞凋亡的變化。8、統(tǒng)計學(xué)分析資料的統(tǒng)計學(xué)分析及繪制統(tǒng)計圖使用GraphPad Prim(version 5.0)軟件。當(dāng)實驗條件只有一個變量,即為兩組數(shù)據(jù)比較有差異與否時用unpaired t test的統(tǒng)計方法。當(dāng)實驗條件為一個以上變量,即兩組以上數(shù)據(jù)時比較使用方差分析的統(tǒng)計方法。P0.05時具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果:1、孢子絲菌病患者皮損中巨噬細(xì)胞的極化方向和Th1和Th2的分化情況。熒光定量PCR結(jié)果顯示:孢子絲菌病患者皮損中,Arginase-1的RNA相對表達量明顯高于iNOS的表達量,p0.05;孢子絲菌病患者皮損IL-2的RNA相對表達量明顯低于正常人皮損,p0.05,孢子絲菌病患者皮損的IL-4的RNA相對表達量高于正常人皮損,p0.05,患者皮損中IFN-γ和IL-10的表達量與正常人無差異。免疫組化結(jié)果顯示:M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物CD206相對表達量明顯多于M1型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD86,p0.05。2、42℃溫?zé)峥赏ㄟ^激活CRAC鈣通道對多種細(xì)胞系的凋亡水平產(chǎn)生影響42℃溫?zé)峥商岣叨喾N皮膚科常用細(xì)胞系的凋亡水平。且除了三種HPV陽性的宮頸癌細(xì)胞系HeLa、Caski和SiHa以外,對于其他幾種細(xì)胞系(包括HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系C33A),溫?zé)峥赏ㄟ^激活CRAC鈣通道增加凋亡水平;即在溫?zé)崽幚砬坝肅RAC鈣通道抑制劑處理細(xì)胞,則溫?zé)釋?xì)胞的凋亡影響被明顯抑制。而對于三種HPV陽性的宮頸癌細(xì)胞系,溫?zé)崆坝肅RAC鈣通道抑制劑處理細(xì)胞,并不能使溫?zé)釋?xì)胞的促進凋亡能力被抑制。這說明對于實驗中所用的幾種細(xì)胞系來說,溫?zé)峥赏ㄟ^激活CRAC鈣通道來增強除了HPV陽性以外細(xì)胞的凋亡水平。而三種HPV陽性的宮頸癌細(xì)胞,溫?zé)釋ζ湓黾拥蛲鏊降淖饔每赡懿煌ㄟ^這一通路,或有其他挽救通路。3、42℃溫?zé)釋奘杉?xì)胞抗原呈遞能力及殺滅胞內(nèi)孢子絲菌能力的影響溫?zé)崽幚砜商岣呔奘杉?xì)胞抗原提呈能力,而在溫?zé)崽幚砬笆褂肅RAC鈣通道抑制劑處理細(xì)胞,則溫?zé)釋奘杉?xì)胞的抗原提呈能力被明顯減弱;這說明42℃溫?zé)峥赏ㄟ^激活CRAC鈣通道提高巨噬細(xì)胞抗原提呈能力。溫?zé)崽幚砗蟮木奘杉?xì)胞,殺滅胞內(nèi)孢子絲菌的能力明顯提高,而溫?zé)崽幚砬笆褂肅RAC鈣通道抑制劑對溫?zé)徇@一影響沒有抑制作用;這說明42℃溫?zé)峥梢蕴岣呔奘杉?xì)胞殺滅胞內(nèi)孢子絲菌能力,但并不通過CRAC鈣通道。溫?zé)崽幚砭奘杉?xì)胞,可使巨噬細(xì)胞與CD4~+T細(xì)胞的共培養(yǎng)體系,殺滅孢子絲菌的能力提高,而CRAC鈣通道抑制劑可明顯抑制溫?zé)徇@一作用;這說明42℃溫?zé)嵬ㄟ^CRAC鈣通道提高巨噬細(xì)胞與CD4~+T細(xì)胞共培養(yǎng)體系的殺滅胞內(nèi)孢子絲菌的能力。4、42℃溫?zé)嶂委熆梢酝ㄟ^激活CRAC鈣通道促進小鼠孢子絲菌病模型的治愈,42℃溫?zé)峥梢酝ㄟ^激活CRAC鈣通道增加皮損中IFN-γ的表達水平。給予孢子絲菌病模型小鼠溫?zé)嶂委?可明顯促進小鼠皮損的消退,而溫?zé)崽幚砬捌?nèi)注射CRAC鈣通道抑制劑BTP2的溫?zé)崽幚硇∈?溫?zé)岽龠M皮損消退的效應(yīng)被明顯減弱;這說明42℃溫?zé)嶂委熆梢酝ㄟ^激活CRAC鈣通道促進小鼠孢子絲菌病模型的治愈。溫?zé)崽幚砜墒规咦咏z菌病模型小鼠皮損處IFN-γ的表達水平,而溫?zé)崽幚砬捌?nèi)注射CRAC鈣通道抑制劑BTP2,可使溫?zé)徇@一作用明顯減弱;這說明42℃溫?zé)峥梢酝ㄟ^激活CRAC鈣通道增加皮損中IFN-γ的表達水平。結(jié)論:1、皮膚型孢子絲菌病病變皮膚標(biāo)本中巨噬細(xì)胞主要向抑制炎癥反應(yīng)的M2方向極化,且輔助性T淋巴細(xì)胞主要向Th2型分化。2、42℃溫?zé)崽岣呔奘杉?xì)胞抗原提呈能力及殺滅胞內(nèi)孢子絲菌能力,且42℃溫?zé)嵬ㄟ^CRAC鈣通道提高巨噬細(xì)胞抗原提呈能力。3、溫?zé)嶂委熤饕ㄟ^激活CRAC鈣通道促進小鼠孢子絲菌病模型的治愈。
【圖文】：

反轉(zhuǎn)錄第一步體系

6圖 2：反轉(zhuǎn)錄第二步體系37oC 15min；85oC 5sec；4oC +∞2.4.5 實時熒光定量PCR采用 SYBR．Green 法進行實時熒光定量 PCR 擴增1、引物設(shè)計引物名稱 序列iNOS-F 5- CAGGGTGTTGCCCAAACTG-3
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R756

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本文編號：2590095