【摘要】：研究背景目前,聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(combined anti-retro viral therapy, cART)雖然可以有效控制HIV (human immunodeficiency virus)的感染和傳播,提高HIV感染者的生活質(zhì)量并延長感染者壽命,但由于治療后HIV潛伏庫的存在使得其不能從根本上治愈HIV感染。HIV潛伏庫中的病毒表現(xiàn)為基因水平幾乎無轉(zhuǎn)錄,蛋白水平完全不表達,因此可逃逸宿主免疫系統(tǒng)的識別和清除。為了克服這一障礙,一種具有較強可行性的“激活再殺滅”策略被提出。這種策略旨在通過活化儲存于宿主細(xì)胞中的休眠前病毒,啟動病毒的復(fù)制周期(激活)從而使得宿主細(xì)胞因病毒誘導(dǎo)的毒性和免疫系統(tǒng)的清除作用而死亡(殺滅)�；谶@一策略,研究者發(fā)現(xiàn)了一系列潛伏感染激活劑(latency reversing agents, LRAs),根據(jù)其作用機制主要分為三大類：(1)表觀修飾劑：包括組蛋白去乙�；敢种苿�(histone deacetylase inhibitors, HDACis),組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(histone methyltransferase inhibitors, HMTis)和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(DNA methyltransferase inhibitors, DNMTis);(2)細(xì)胞因子調(diào)節(jié)劑：包括PKC/NF-κB通路激活劑和轉(zhuǎn)錄延伸因子p-TEFb (positive transcription elongation factor b)激活劑；(3)免疫調(diào)節(jié)劑：包括IL-2、IL-7、IL-15和OKT3抗體等。遺憾的是,絕大部分激活劑在臨床試驗中與cART聯(lián)用后,并未達到清除或縮小潛伏庫的目的。造成這種現(xiàn)象可能的原因有如下兩點：(1)激活劑在體內(nèi)無選擇性地促進廣泛T細(xì)胞活化反而使得機體內(nèi)CD4+T細(xì)胞快速減少；(2)激活劑無法誘導(dǎo)或?qū)TL (cytotoxic T lymphocyte)反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用,致使?jié)摲麳IV被激活后潛伏庫無法被機體免疫系統(tǒng)及時清除�？傊�,目前在臨床試驗中被證明能達到縮小HIV潛伏庫效果的藥物僅有兩種組蛋白去乙�；敢种苿毫_米地辛(Romidepsin)和帕比司他(Panobinostat)。近年來,多個細(xì)胞因子和病毒蛋白被發(fā)現(xiàn)與HIV的潛伏密切相關(guān),如HIV Tat蛋白在靜息期CD4+T細(xì)胞中的缺失能抑制病毒的轉(zhuǎn)錄起始和延伸。這也被認(rèn)為是HIV形成潛伏的原因之一。然而,針對宿主細(xì)胞和病毒分子的相互作用調(diào)控HIV整合后的潛伏或激活的研究不多。有研究通過全基因組siRNA篩選的方法得到842個與HIV感染相關(guān)的宿主基因。另有研究通過全基因組蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)HEK-293和Jurkat細(xì)胞系中的435個宿主細(xì)胞分子與HIV蛋白能產(chǎn)生直接的相互作用。盡管如此,目前僅有極少數(shù)細(xì)胞因子被發(fā)現(xiàn)能影響HIV的潛伏形成或激活,更多類似的細(xì)胞因子等待著被發(fā)掘。研究目的近年來,研究人員發(fā)現(xiàn)多種參與HIV潛伏形成、維持和激活的細(xì)胞因子。其中宿主細(xì)胞中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與分子伴侶HSP90(heat shock protein 90)能調(diào)控HIV潛伏激活。此外,HSP40(heat shock protein 40)和HSP70(heat shock protein 70)也分別與病毒蛋白Nef和Tat產(chǎn)生直接的相互作用。眾所周知,熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)作為分子伴侶廣泛地參與應(yīng)激反應(yīng)下細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的蛋白穩(wěn)態(tài)過程,而熱休克蛋白的轉(zhuǎn)錄因子HSF1(heat shock factor 1)也被報道廣泛參與這一過程。因此,我們推測HSF1可能直接參與HIV的潛伏激活。而HSF1被證明可結(jié)合于HIV轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)5'-LTR(long terminal repeat),并積極地參與HIV的生命活動,這進一步印證了上述假說。本研究擬深入揭示轉(zhuǎn)錄因子HSF1調(diào)控潛伏HIV激活的分子機制,同時以HSF1介導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)潛伏HIV活化為重點研究對象,探討HSF1活化形式參與HIV潛伏激活的調(diào)控機理。在此基礎(chǔ)上,充分探索HSF1作為潛伏HIV激活靶點的可能性,為HIV治愈的研究及治療提供新的思路。研究方法1.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)J-lat 10.6細(xì)胞是HIV經(jīng)典的潛伏細(xì)胞模型之一,因其潛伏的HIV基因組中包含有GFP報告基因而廣泛用于HIV潛伏激活劑篩選。本文采用J-lat 10.6細(xì)胞系作為主要實驗對象。研究使用多種應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)劑包括Salubrinal和Carfilzomib刺激J-lat 10.6細(xì)胞,隨后采用流式細(xì)胞儀檢測J-lat 10.6細(xì)胞的陽性GFP%,以此來評估激活劑的激活活性。同樣地,我們采用細(xì)胞信號通路或細(xì)胞內(nèi)調(diào)控因子抑制劑或激動劑與文中發(fā)現(xiàn)的激活劑來共同處理J-lat 10.6細(xì)胞,運用FCM檢測處理后J-lat 10.6細(xì)胞的陽性GFP%,以此來檢測信號通路中細(xì)胞因子(p300、p-TEb、HSP90等)的參與作用。此外,我們采用激活劑處理人PBMCs (peripheral blood mononuclear cells),通過對T細(xì)胞表面活化標(biāo)志物CD25和CD69染色,隨后運用FCM檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達,以此來評價激活劑對T細(xì)胞活化程度的影響。2.細(xì)胞毒性試驗本文采用CCK-8法檢測激活劑或與抑制劑共處理J-lat 10.6、U1、ACH2. PBMCs等細(xì)胞時化合物對于細(xì)胞存活率的影響,為客觀判斷激活劑或抑制劑對潛伏HIV活化的影響提供依據(jù)。3.蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)研究通過核質(zhì)分離方法提取Salubrinal, Bortezomib和Carfilzomib或多種經(jīng)典激活劑處理J-lat 10.6細(xì)胞2小時內(nèi)的胞核蛋白,并采用蛋白質(zhì)免疫印跡來分析多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(包括轉(zhuǎn)錄起始因子NF-κB、NFAT、AP-1、HSF1、轉(zhuǎn)錄延伸因子p-TEFb、染色質(zhì)表觀修飾酶p300)的核內(nèi)累積水平。以此來判斷潛伏HIV激活劑對轉(zhuǎn)錄起始因子、轉(zhuǎn)錄延伸因子、染色質(zhì)解構(gòu)因子的促進或抑制作用。另外,我們通過提取潛伏激活劑或與相應(yīng)抑制劑共處理細(xì)胞后的總蛋白,采用WB分析HIV蛋白p24、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志物p-eIF2α(a subunit ofeukaryotic translation initiation factor)、HSP90、CDK9等蛋白的表達水平,從而評估激活劑或抑制劑對這些蛋白總體水平的影響。4.熒光定量PCR (qPCR)研究通過提取激活劑處理J-lat 10.6、U1、ACH2、PBMCs、CD4+T細(xì)胞等細(xì)胞12、24或48小時的總RNA,隨后逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA,最后運用相應(yīng)基因引物針對HIV轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)LTR、HIV相關(guān)基因、轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因、免疫因子基因、細(xì)胞表面受體基因等進行檢測。運用熒光定量PCR實驗獲得對應(yīng)基因和樣本的Ct (cycle threshold)值,通過計算Ct值來分析對應(yīng)基因的相對表達增長倍數(shù),從而來判斷激活劑如Salubrinal、Bortezomib和Carfilzomib等對HIV基因(LTR、Gag、Tat、Vif、Vpr)、轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因(HSF1、RelA、NF-κB1、 c-foc、ATF3、NFATcl和NFATc2)、細(xì)胞因子基因(TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6, IL-10、IL-12P、IL-13、IL-17α、IL-18)轉(zhuǎn)錄水平的促進作用,以及對細(xì)胞表面受體(CD86, CD69、CD4、CXCR4)的抑制作用。熒光定量PCR結(jié)果在基因水平印證WB所獲得的蛋白水平的結(jié)果,使得本文研究數(shù)據(jù)更加充實可信。5.酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)為檢測激活劑Carfilzomib對天然免疫因子IL-1p和IL-18釋放的影響,研究通過收集Carfilzomib刺激J-lat 10.6和Jurkat細(xì)胞不同時間點后細(xì)胞培養(yǎng)上清,運用ELISA法來檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β和IL-18的濃度。以此來評估激活劑對細(xì)胞天然免疫反應(yīng)的促進作用和對潛伏HIV激活后免疫清除步驟的有利影響。6.激光掃描共聚焦顯微鏡(Confocal)研究采用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)來定位HSP90和CDK9兩個分子在激活劑Carfilzomib的刺激下在U1細(xì)胞內(nèi)的分布,通過分析二者是否共存于處理后的細(xì)胞中來初步判斷二者是否存在直接相互作用關(guān)系。7.免疫共沉淀(Co-IP)為探究HSF1在潛伏HIV轉(zhuǎn)錄活化中的分子機制,我們采用免疫共沉淀技術(shù)分析與轉(zhuǎn)錄起始因子HSF1產(chǎn)生直接相互作用的細(xì)胞調(diào)控因子,其中包括轉(zhuǎn)錄延伸因子亞基CDK9、CyclinT1和乙�；竝300。通過分析HSF1對p-TEFb的募集作用從而來證明HSF1促進轉(zhuǎn)錄延伸的功能,并通過分析HSF1對p300的募集作用來探索HSF1乙�；跐摲麱IIV活化中發(fā)揮的作用。同時,我們采用IP來分析HSF1自身的乙�；揎椝�。除此之外,我們運用Co-IP分析CDK9與HSP90之間的直接結(jié)合作用并采用IP分析CDK9在Carfilzomib刺激下的泛素化水平。8.凝膠遷移實驗(EMSA)研究通過核質(zhì)分離法提取Salubrinal處理J-lat 10.6細(xì)胞2小時內(nèi)的核蛋白,采用核蛋白與帶有生物素標(biāo)記的HSF1或NF-κB探針分別共同孵育,最后通過非變性膠來分離遷移條帶。此方法可在胞體外鑒定轉(zhuǎn)錄因子HSF1和NF-κB與HIV轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)LTR產(chǎn)生的結(jié)合作用。9.染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)為進一步分析轉(zhuǎn)錄因子HSF1和NF-κB在細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下與HIV轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)LTR的結(jié)合作用,研究運用染色質(zhì)免疫共沉淀來分析HSF1和NF-κB在激活劑刺激下結(jié)合于HIV LTR的量。研究分別采用HSF1和RelA抗體來做ChIP實驗,通過定量PCR來分析HSF1和RelA抗體拉下來的基因組DNA中HIV LTR的量。此實驗真實地反應(yīng)HSF1和NF-κB在激活劑刺激下與HIV LTR的結(jié)合情況。10. TALEN敲除為深入探究HSF1對于HIV轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵作用,我們采用TALENC transcription activator-like effector nuclease)技術(shù)敲除HSF1基因。根據(jù)HSF1基因(NCBI gene ID:3297)設(shè)計TALEN臂,并使用FAST TALEN Kit構(gòu)建TALEN臂質(zhì)粒。五個質(zhì)粒以L2xR3交互組合方式轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素篩選3天,隨后通過基因組PCR產(chǎn)物測序分析得到敲除效率最佳組合。最后通過2周的單細(xì)胞培養(yǎng)方式篩選敲除的單克隆細(xì)胞,并通過測序和WB鑒定得到293 T-HSF1-/-(-4bp/-10bp)敲除細(xì)胞系。11.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染研究采用pNL4-3-luc單獨轉(zhuǎn)染或與pEZ-HSF1共轉(zhuǎn)染293T-WT或293T-HSF1-/-細(xì)胞來探索HSF1高表達或缺失對HIV轉(zhuǎn)錄的影響。轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒DNA按比例轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時后,裂解細(xì)胞,檢測熒光素活性。根據(jù)相對活性倍數(shù)來評估HSF1對HIV轉(zhuǎn)錄的影響。12.數(shù)據(jù)分析文中所有柱狀圖及線圖均采用GraphPad Prism 5.0軟件來制作,所有WB條帶均使用Adobe Photoshop CS 5.0軟件來處理,流式細(xì)胞數(shù)據(jù)采用FlowJo 7.6軟件來處理,熒光圖片使用Olympus FV10-ASW1.7 Viewer來分析。文中數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用GraphPad Prism 5.0軟件來分析,所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)來表示,且p值定義如下：*p0.05,***0.01和***p0.001。實驗結(jié)果1.通過FCM篩選,我們發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激、免疫應(yīng)激、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可在不同程度上促進潛伏HIV激活,且能有效引起應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志物p-eIF2a水平增加。我們還發(fā)現(xiàn),p-eIF2a去磷酸化酶GADD34抑制劑Salubrinal在引起應(yīng)激反應(yīng)的同時能促進潛伏HIV激活。這一結(jié)果在多種細(xì)胞模型包括J-lat 10.6、 U1、ACH2和病人離體CD4+T細(xì)胞上得到驗證,證明了應(yīng)激反應(yīng)促進潛伏HIV活化作用具有普遍性。通過進一步研究,我們發(fā)現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)劑Salubrinal活化潛伏HIV時不引起廣泛T細(xì)胞活化。2.透過深入研究應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)的潛伏HIV活化,我們發(fā)現(xiàn)HSF1在Salubrinal誘導(dǎo)的潛伏HIV激活中起主導(dǎo)作用,同時我們也檢測到轉(zhuǎn)錄因子HSF1的下游效應(yīng)因子HSP27、HSP70、HSP90廣泛參與Salubrinal誘導(dǎo)的潛伏HIV激活過程。在深入研究HSF1參與潛伏HIV激活的分子機制過程中,我們不僅通過EMSA和ChIP實驗證明HSF1結(jié)合于HIV LTR發(fā)揮轉(zhuǎn)錄起始作用,還通過Co-IP實驗證明HSF1募集轉(zhuǎn)錄延伸因子p-TEFb來發(fā)揮轉(zhuǎn)錄延伸作用。除此之外,HSF1通過募集乙酰化酶p300促使自身發(fā)生乙�；揎椧彩荋SF1介導(dǎo)潛伏HIV激活的重要機制之一。3.通過深入研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的潛伏HIV激活,我們發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑Carfilzomib可在納摩爾濃度級別高效低毒地激活潛伏HIV,且能在HIV病人離體CD4+T細(xì)胞上有效地增強經(jīng)典激活劑Prostratin、SAHA、JQ1對潛伏HIV的激活作用。值得一提的是,Carfilzomib誘導(dǎo)的潛伏HIV不引起廣泛T細(xì)胞活化的同時,還能選擇性促進天然免疫反應(yīng)因子IL-1p和IL-18的生成和釋放。通過進步一探索蛋白酶體抑制劑介導(dǎo)的潛伏HIV活化,我們也發(fā)現(xiàn)HSF1在其中發(fā)揮主導(dǎo)作用。4.在對HSF1下游因子HSP90的研究中,我們發(fā)現(xiàn)HSP90抑制劑17-DMAG、 AUY922不僅可促進HSP90 mRNA和蛋白表達,還可在J-lat 10.6細(xì)胞上誘導(dǎo)潛伏HIV活化。此外,我們還證明HSP90抑制劑可增強蛋白酶體抑制劑和多通路經(jīng)典激活劑激活潛伏HIV的效應(yīng)。同樣地,我們也發(fā)現(xiàn)p-TEFb在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)的潛伏HIV活化中發(fā)揮重要作用。而通過Co-IP實驗,我們證明HSP90可結(jié)合于p-TEFb亞基CDK9上保護CDK9減少泛素化介導(dǎo)的降解。5.通過探索HSF1介導(dǎo)潛伏HIV激活作用的廣泛性,我們檢測到HSF1的活化形式p-HSF1(Ser320)及HSF1下游因子HSP70和HSP90在經(jīng)典通路激活劑Dilazep、SAHA、JQ1、Prostrating、TNF-α激活潛伏HIV的過程中均發(fā)揮作用。采用TALEN技術(shù)敲除HSF1基因后,我們得到293T-HSF1-/-(-4bp/-10bp)單克隆細(xì)胞株。通過在缺失HSF1和過表達HSF1的細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染pNL4-3-luc,我們發(fā)現(xiàn)HSF1敲除可大大削減HIV的轉(zhuǎn)錄活性,而過表達HSF1并且促使其轉(zhuǎn)變成活性形式可促進HIV的轉(zhuǎn)錄。因此我們認(rèn)為HSF1在HIV的轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,具有作為潛伏激活劑篩選靶點的潛力。最后,依據(jù)此效應(yīng)靶點我們進行廣泛篩選,得到一系列激活劑。本文結(jié)論本文的結(jié)果證明Salubrinal和Carfilzomib誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)可促進潛伏HIV活化,且不伴隨廣泛T細(xì)胞活化。其中蛋白酶體抑制劑Carfilzomib還可選擇性促進天然免疫因子的釋放。通過一系列細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)實驗我們證明應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的潛伏HIV活化是通過轉(zhuǎn)錄起始因子HSF1介導(dǎo)的,其具體作用機理為：HSF1在應(yīng)激反應(yīng)下發(fā)生磷酸化(Ser320),p-HSF1入核后募集p300乙�；陨韽亩罨�；活化的HSF1與HIV LTR靶向結(jié)合,同時募集p-TEFb促進基因轉(zhuǎn)錄延伸；HSF1下游效應(yīng)因子HSP90在此過程中與p-TEFb亞基CDK9結(jié)合發(fā)揮保護作用,從而產(chǎn)生對HSF1的正反饋效應(yīng)。最后我們證明HSF1在HIV的轉(zhuǎn)錄中是不可或缺的,是HIV轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子,具有成為藥物開發(fā)靶點的潛力。
【圖文】：

圖１；邋ＨＩＶ潛伏庫的形成Ｗ

圖２；邋‘‘薇活再殺滅＂策略示意圖ＰＷ。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ‘‘ｓｃｈｏｃｋ邋ａｎｄ邋ｋｉｉｒ’ｓｔｒａｔｅｇｙ．逡逑潛伏激活劑及激活機制逡逑大量研巧表明，，在ＨＩＶ整合后潛伏的過程中，病毒和細(xì)胞均發(fā)揮著非常關(guān)逡逑
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R512.91

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9 李曉東;如何消除家禽應(yīng)激反應(yīng)[N];西藏日報;2004年

10 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 顧憲紅博士;豬的應(yīng)激反應(yīng)與環(huán)境營養(yǎng)[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2005年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前9條

1 施蕓岑;持續(xù)輸注右美托咪定對老年骨科患者圍手術(shù)期應(yīng)激反應(yīng)和恢復(fù)質(zhì)量的影響[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

2 劉巖;應(yīng)激反應(yīng)模型及其在應(yīng)對規(guī)劃中的應(yīng)用研究[D];東北師范大學(xué);2015年

3 陳華溶;OLA1作為整合應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控因子對腫瘤生長轉(zhuǎn)移的影響[D];浙江大學(xué);2014年

4 孫麗娜;應(yīng)激反應(yīng)對SIRT1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制探討及其在相關(guān)疾病中的意義[D];南京醫(yī)科大學(xué);2014年

5 潘曉彥;熱休克因子1介導(dǎo)潛伏HIV-1激活的分子機制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

6 蘇帆;從氣血理論探討圍術(shù)期應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控及相關(guān)并發(fā)癥防治[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2013年

7 申海鷹;Hsp90功能域多態(tài)性的鑒定及其對小鼠應(yīng)激反應(yīng)的影響[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2002年

8 陳新春;全身麻醉不停跳冠脈旁路移植患者應(yīng)激反應(yīng)、血流動力學(xué)及心肌酶譜的變化研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2006年

9 黃倩;大鼠抑郁模型中性激素對應(yīng)激反應(yīng)的作用及其調(diào)節(jié)機制[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 楊帆;嬰幼兒心內(nèi)直視術(shù)后不同鎮(zhèn)靜方式對應(yīng)激及心肌損傷變化趨勢的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

2 劉莉;不同方法對急性創(chuàng)傷性應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控效果的影響[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2015年

3 田春;單側(cè)腰麻和全身麻醉對老年髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的應(yīng)激反應(yīng)影響的對比研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

4 郝倩;不同劑量鹽酸右美托咪定對無抽搐電休克術(shù)患者應(yīng)激反應(yīng)的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2016年

5 高康;突變p53蛋白p53~(N236S)在DFO模擬的缺氧應(yīng)激反應(yīng)中的作用及相關(guān)機制初探[D];昆明理工大學(xué);2016年

6 蔣宗濱;不同劑量芬太尼對不停跳體外循環(huán)心臟手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)影響的研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2001年

7 潘中心;兩種麻醉方法對結(jié)腸癌手術(shù)病人應(yīng)激反應(yīng)的影響[D];鄭州大學(xué);2005年

8 梁立升;兩種麻醉方法對腹腔鏡膽囊切除術(shù)老年人應(yīng)激反應(yīng)的影響[D];青島大學(xué);2007年

9 戚甫建;圍手術(shù)期應(yīng)激反應(yīng)對術(shù)后康復(fù)的影響[D];暨南大學(xué);2009年

10 王玉;大學(xué)生非理性信念對其震后應(yīng)激反應(yīng)的預(yù)測研究[D];四川師范大學(xué);2009年

本文編號：2556579