【摘要】：目的艾滋病嚴(yán)重危害著人類的健康與生命。如何清除艾滋病毒潛伏感染靶細(xì)胞一直是艾滋病研究的焦點(diǎn),而單核-巨噬細(xì)胞對HIV-1感染發(fā)生凋亡抵抗,是重要的HIV-1潛伏感染靶細(xì)胞。因此,本研究探討HIV-1感染單核-巨噬細(xì)胞的凋亡機(jī)制,為尋找清除艾滋病毒感染的單核-巨噬細(xì)胞藥物及措施提供理論依據(jù)。 方法本研究首先以THP1單核細(xì)胞和THP1源性巨噬細(xì)胞為細(xì)胞模型,用R5嗜性的HIV-1全長感染性質(zhì)粒包裝并獲得HIV-1病毒,體外感染THP1單核細(xì)胞與THP1源性巨噬細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀Annexin-V/7-AAD染色檢測細(xì)胞凋亡情況,進(jìn)一步確認(rèn)巨噬細(xì)胞對HIV-1感染的凋亡抵抗作用。采用Westernblotting方法檢測巨噬細(xì)胞感染HIV-1后Bcl-2家族中促、抗凋亡分子的表達(dá)變化,明確巨噬細(xì)胞對HIV-1感染的凋亡抵抗作用與Bcl-2家族中促、抗凋亡分子的表達(dá)量間的關(guān)系。為清除HIV-1感染的巨噬細(xì)胞,本研究首先采用經(jīng)典的凋亡誘導(dǎo)分子誘導(dǎo)HIV-1感染的巨噬細(xì)胞凋亡。然后,利用流式細(xì)胞儀Annexin-V/7-AAD染色和線粒體膜電位損失檢測Galecti n-3誘導(dǎo)HIV-1感染巨噬細(xì)胞凋亡,并從艾滋病恒河猴模型分離獲得的巨噬細(xì)胞加以驗(yàn)證。 在前期基礎(chǔ)上,本研究深入探索Galectin-3誘導(dǎo)HIV-1感染單核-巨噬細(xì)胞的凋亡機(jī)制,通過采用不同的Caspase抑制劑、檢測Caspase-3底物PARP和檢測Caspase-3的切割活性等方法對細(xì)胞凋亡的Caspase通路分析。采用Western blotting方法檢測Galectin-3誘導(dǎo)HIV-1感染的巨噬細(xì)胞凋亡前后促、抗凋亡分子的表達(dá)變化、細(xì)胞色素C的表達(dá)變化及Caspase非依賴性的細(xì)胞凋亡通路中的AIF與EndoG的表達(dá)變化。 此外,我們采用基因沉默技術(shù)對人單核巨噬細(xì)胞株U937的90K/Mac-2BP基因沉默,從而闡明90K/Mac-2BP對HIV-1感染單核巨噬細(xì)胞凋亡的影響。 結(jié)果本文首先再次確認(rèn)了THP1源性巨噬細(xì)胞對HIV-1感染的凋亡抵抗作用,即HIV-1感染單核細(xì)胞,對照組和感染組凋亡率分別為：(6.99±0.54)%,(28.82±1.03)%,結(jié)果具有顯著差異,而HIV-1感染THP1源性巨噬細(xì)胞對照組和感染組凋亡率分別為：(5.42±0.47)%,(7.91±0.49)%,結(jié)果無顯著差異。此外,本研究首次發(fā)現(xiàn)Galectin-3能夠誘導(dǎo)單核細(xì)胞凋亡,凋亡率分別為：對照組(6.13±0.70)%,加入Galectin-3后(20.46±0.62)%,結(jié)果具有顯著差異。更為重要的是,本研究發(fā)現(xiàn)Galectin-3能夠誘導(dǎo)HIV-1感染的巨噬細(xì)胞凋亡,其中未感染組細(xì)胞加入Galectin-3前后的凋亡率分別為：(5.31±0.18)%,(11.2±0.32)%。而HIV-1感染組細(xì)胞加入Galectin-3前后的凋亡率分別為：(15.56±1.56)%,(29.78±1.94)%,結(jié)果具有顯著差異。 在此基礎(chǔ)上,我們證實(shí)了Galectin-3誘導(dǎo)的單核細(xì)胞(THP1)與HIV-1感染的巨噬細(xì)胞(THP1-MACs HIV-1+)凋亡與Caspase通路無關(guān),與促凋亡蛋白(Bax)、抗凋亡蛋白(Mcl-1、Bcl-2.Bcl-xL)無關(guān),也與線粒體事件相關(guān)的細(xì)胞色素C(Cyto C)和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)無關(guān),而是與核酸內(nèi)切酶G(Endo G)的核轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 另外,本研究結(jié)果顯示正常人單核巨噬細(xì)胞株U937,經(jīng)HIV-1感染后細(xì)胞凋亡率為(16.27±0.30)%,而90K/Mac-2BP基因沉默后的U937細(xì)胞,經(jīng)HIV-1感染后細(xì)胞凋亡率分別增加至(31.26±0.35)%、(25.76±0.30)%、(23.69±0.33)%,具有統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論本研究發(fā)現(xiàn)Galectin-3能夠誘導(dǎo)HIV-1感染單核-巨噬細(xì)胞凋亡及其機(jī)制與EndoG的核轉(zhuǎn)移相關(guān),同時發(fā)現(xiàn)作為Galectin-3配體的9OK/Mac-2BP分子基因沉默后能增強(qiáng)HIV-1感染單核-巨噬細(xì)胞的凋亡,這為探尋清除HIV-1感染單核-巨噬細(xì)胞的措施提出了新的理論依據(jù),并從清除艾滋病毒潛伏感染靶細(xì)胞的角度為研發(fā)艾滋病治療的新藥提供線索。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R512.91

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2554726