【摘要】：目的：中醫(yī)對(duì)結(jié)核病（Tuberculosis，TB）在唐朝就形成了“癆蟲”之說，1882年羅伯特·科赫發(fā)現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium Tuberculosis，MTB），證明了“癆蟲”即為MTB是TB的發(fā)病原因。為了進(jìn)一步發(fā)展中醫(yī)對(duì)TB的認(rèn)識(shí)，我們采用現(xiàn)代技術(shù)和方法對(duì)MTB進(jìn)行深入研究；本論文采用生物信息學(xué)和免疫學(xué)對(duì)MTB的RD12和RD5區(qū)抗原進(jìn)行評(píng)估，從而為中西醫(yī)結(jié)合在肺癆方面的發(fā)展提供實(shí)驗(yàn)室研究依據(jù)。 方法：在NCBI數(shù)據(jù)庫上查詢并獲得各個(gè)抗原的氨基酸序列，用Blast分析其與MTB復(fù)合群及人類蛋白的同源性。利用SYFPEITHI、NETCTL、BIMAS和NetMHC數(shù)據(jù)庫預(yù)測并分析MTB的RD12區(qū)和RD5區(qū)抗原CD8+T細(xì)胞表位的分布情況；利用NetMHC數(shù)據(jù)庫預(yù)測并分析MTB的RD12區(qū)和RD5區(qū)抗原的CD4+T細(xì)胞表位的分布情況。然后，綜合CD4+T和CD8+T表位預(yù)測，篩選出優(yōu)勢表位肽段。用pET32a載體和pET28b載體分別與RD5區(qū)抗原Rv3117和RD12區(qū)抗原Rv2074構(gòu)建重組載體，用原核表達(dá)出結(jié)核特異性抗原，通過Ni-NTA柱純化蛋白，利用Triton X-114在4℃能與水混溶，而在37℃能與水形成水相與去污相的特點(diǎn)，用相分離法去除Rv3117和Rv2074蛋白中的內(nèi)毒素，然后分別用顯色基質(zhì)鱟試劑法和BCA法測定目的蛋白的內(nèi)毒素含量和蛋白質(zhì)濃度。收集臨床結(jié)核病患者和健康對(duì)照者的血清，用ELISA檢測血清中抗結(jié)核特異性抗原Rv3117和抗Rv2074的體液免疫反應(yīng)，篩選出特異性和敏感性較高的特異性優(yōu)勢抗原Rv3117。用純化并去除內(nèi)毒素的蛋白R(shí)v3117免疫C57BL/6小鼠，Westernblotting檢測小鼠血清中抗結(jié)核分枝桿菌Rv3117的IgG抗體；用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測Rv3117誘導(dǎo)C57BL/6小鼠脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性IFN-γ的斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)（SpotForming Cells, SFC）；進(jìn)一步收集臨床活動(dòng)性結(jié)核患者和健康對(duì)照的全血，并分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral Blood Mononμclear Cell, PBMCs），，用ELISPOT試驗(yàn)檢測Rv3117分別刺激結(jié)核病患者和健康對(duì)照PBMCs產(chǎn)生特異性IFN-γ的SFC。 結(jié)果：通過預(yù)測與分析，并綜合CD4+T和CD8+T預(yù)測結(jié)果，初步篩選出MTB RD12區(qū)4個(gè)抗原的13個(gè)優(yōu)勢表位肽段；RD5區(qū)5個(gè)抗原的23個(gè)優(yōu)勢表位肽段。本文選擇結(jié)核分枝桿菌RD12區(qū)特異性抗原Rv2074和RD5區(qū)特異性抗原Rv3117以及公認(rèn)的具有較強(qiáng)免疫原性的抗原CFP-10和ESAT-6，分別對(duì)65例結(jié)核�。═uberculosis, TB）患者的血清和59例健康對(duì)照患者的血清進(jìn)行抗結(jié)核抗體檢測，結(jié)果顯示RD5區(qū)抗原Rv3117能夠引起65例TB患者血清IgG水平提高，與59例健康對(duì)照者相比，具有顯著性差異（p0.05），并且其誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG水平的敏感性/特異性(26.20%/98.30%）與CFP-10（24.60%/94.90%）、ESAT-6(24.60%/96.60%)相當(dāng)；而RD12區(qū)抗原2074不能引起TB患者和健康對(duì)照者的顯著性差異（p0.05）。 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)結(jié)果顯示0.10μg/mL、1.00μg/mL和10.00μg/mL的Rv3117均能引起小鼠脾臟淋巴細(xì)胞產(chǎn)生較高水平的Rv3117抗原特異性IFN-γ，與對(duì)照組CFP-10免疫的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞相比，二者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p0.05）。反之，不同濃度的CFP-10刺激CFP-10免疫的C57BL/6小鼠CFP-10抗原特異性T細(xì)胞產(chǎn)生釋放IFN-γ，而對(duì)Rv3117免疫的C57BL/6小鼠產(chǎn)生CFP-10抗原特異性的T細(xì)胞釋放IFN-γ無作用。 臨床病例標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)顯示，用20.00μg/mL的Rv3117分別刺激TB病人和健康對(duì)照者的PBMCs，Rv3117在區(qū)分TB患者組和健康對(duì)照組PBMCs產(chǎn)生的抗原特異性IFN-γ水平之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）。采用不同濃度的Rv3117刺激TB患者（n=17）PBMCs釋放抗原特異性IFN-γ水平實(shí)驗(yàn)顯示，1.00~20.00μg/mL的重組Rv3117不能刺激TB患者產(chǎn)生IFN-γ（p0.05）。 結(jié)論：借助現(xiàn)代技術(shù)和方法對(duì)中醫(yī)關(guān)于結(jié)核病的“癆蟲”假說進(jìn)行深入探討是發(fā)展中醫(yī)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)“癆病”和“癆蟲”本質(zhì)的必要手段。本課題采用生物信息學(xué)和免疫學(xué)對(duì)MTB的RD12和RD5區(qū)抗原進(jìn)行評(píng)估，初步評(píng)估出了結(jié)核特異性抗原Rv3117，雖然Rv3117不能作為抗結(jié)核診斷的免疫學(xué)指標(biāo)，但其作為僅存在于MTB致病菌株H37Rv中的抗原，對(duì)其抗原免疫學(xué)功能的進(jìn)一步研究有助于結(jié)核新型疫苗的研究和抗結(jié)核藥物的開發(fā)，并對(duì)探索結(jié)核的致病機(jī)制具有十分重要的意義，為中西醫(yī)結(jié)合預(yù)防、診斷及治療結(jié)核病提供研究依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R52

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李賀;張培因;衛(wèi)紅飛;曹昭;王影;王華;胡小平;萬敏;王麗穎;于永利;;重組卡介苗熱休克蛋白70的純化及內(nèi)毒素去除的效果評(píng)價(jià)[J];吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2010年01期

2 閆曉曉;王洪海;張舒林;;RD區(qū)編碼蛋白在結(jié)核病免疫診斷中的研究進(jìn)展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2010年20期

3 張小剛,何秀云,熊志紅,李書琳,張永勝;重組結(jié)核分支桿菌38000蛋白質(zhì)抗原免疫學(xué)特性的研究[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2002年01期

4 封莉;葉娟;王鳳平;趙俊偉;吳興福;張舒林;;結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESXO的重組制備及其免疫原性評(píng)估[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年11期

5 湯俊明;陳翠翠;王學(xué)才;趙俊偉;張舒林;;結(jié)核分枝桿菌特異性抗原Rv3117的克隆表達(dá)和誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的實(shí)驗(yàn)研究[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年11期

6 成詩明;;我國結(jié)核病研究概況[J];中國防癆雜志;2011年09期

7 馬s

本文編號(hào)：2543382