【摘要】：研究背景據(jù)報道全球約20億人有既往或現(xiàn)癥乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染的血清學證據(jù),其中2.4億人為慢性HBV感染者。慢性HBV感染往往會進展為終末期肝病、肝硬化以及原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),年死亡人數(shù)可達65萬人。HBV感染持續(xù)存在的原因是多方面的,包括抗原加工和提呈受到抑制、免疫抑制微環(huán)境(IL-10,TGF-p).CD4 T細胞反應低下、細胞因子分泌抑制、負性調(diào)控(PD-1/CTLA-4/Tim-3)、T細胞和B細胞抗原表位逃逸突變、免疫細胞缺失或耗竭(由于高病毒載體或負性調(diào)節(jié))等。其中,樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)提呈HBV抗原功能缺陷和共刺激分子表達低下,是造成HBV感染持續(xù)存在的一個重要原因。作為一種Ⅱ型跨膜蛋白,DC-SIGN(DC-specific ICAM-3 grabbing non-integrin)是含有外源性甘露糖結(jié)合位點的C型凝集素(C-type lectin,CLR)結(jié)構(gòu)域。其主要表達于淋巴組織成熟DCs與外周組織未成熟IDCs表面,在DCs識別病原體相關(guān)分子模式、激活初始T細胞及啟動免疫應答,以及病原體的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。有研究顯示DC-SIGN可以識別多種含有高甘露糖寡糖的病毒(例如丙型肝炎病毒,人類免疫缺陷病毒和埃博拉病毒)。HBV是一種DNA病毒,它的包膜蛋白包括大表面抗原、中表面抗原和小表面抗原,均含有豐富的甘露糖寡糖,因此DC-SIGN很可能參與對HBV的識別。N-糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后的一種重要修飾,α-甘露糖苷酶Ⅰ特異性地作用于甘露糖a-1,2糖苷鍵,可以剪切N-寡糖中的甘露糖殘基,使糖蛋白發(fā)生去甘露聚糖修飾,由高甘露糖型變?yōu)殡s合型或復雜型。而M. L. Op den Brouw等人的研究揭示了HBV在一定情況下可以被DC-SIGN識別：盡管天然HBV不能與DC-SIGN結(jié)合,但用α-甘露糖苷酶Ⅰ抑制劑基夫堿處理產(chǎn)HBV顆粒和乙肝表面抗原的HepG2.2.15細胞,由此產(chǎn)生的高甘露糖HBV和乙肝表面抗原則可被DC-SIGN識別。我們之前體外研究的結(jié)果顯示,與Hep G2細胞相比,Hep G2.2.15細胞MAN1A1、MAN1A2的表達明顯上調(diào)。盡管HBV DNA在外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的存在形式、傳染性和致病性存在爭議,但PBMC無疑是HBV肝外感染的重要靶器官。本研究首先通過收集處于不同臨床病程的HBV感染者的外周血,比較和分析不同臨床病程α-甘露糖苷酶Ⅰ的表達水平,及其與臨床病程、細胞免疫應答之間的關(guān)系。另外通過構(gòu)建a-甘露糖苷酶Ⅰ亞型MAN1A1的過表達和干擾重組腺病毒載體,觀察MAN1A1的表達水平與乙肝表面抗原甘露糖修飾之間的關(guān)系,初步探討a-甘露糖苷酶Ⅰ表達水平對HBV感染的影響。研究目的在前期研究工作基礎(chǔ)上,比較和分析α-甘露糖苷酶Ⅰ在不同臨床病程HBV感染中的表達水平,并初步探討α-甘露糖苷酶Ⅰ表達水平對HBV感染的影響。實驗方法1.收集90名HBV感染者和30名健康對照者的外周血,其中HBV感染者根據(jù)臨床病程分為免疫耐受組、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)組、非活動性HBsAg攜帶組；2.Western Blot法檢測a-甘露糖苷酶Ⅰ三個亞型MAN1A1、MAN1A2和MAN1C1蛋白的表達水平,ELISA法檢測血清白介素-12(interleukin 12, IL-12)和丫-干擾素(IFN-γ)水平以及乙肝血清學標志物,RT-PCR方法檢測HBV DNA;3.使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析,比較和分析a-甘露糖苷酶Ⅰ在不同階段HBV感染中的表達水平,及其與IL-12、IFN-γ、HBV DNA的關(guān)系：4.根據(jù)Genebank中查詢獲得的人MAN1A1基因設(shè)計并合成特異的shRNA序列,然后通過分子克隆的方法構(gòu)建MAN1A1的干擾穿梭載體pBSilence1.1-MAN1A1-shRNA,酶切和測序鑒定：5.根據(jù)Genebank查詢獲取MAN1A1基因的編碼序列,人工合成含有目的基因片段的質(zhì)粒pUC57-MAN1A1,將其與pYr-adshuttle-4穿梭質(zhì)粒連接,構(gòu)建MAN1A1基因的過表達穿梭載體pYr-MAN1A1,酶切和測序鑒定；6.將上述干擾載體pBSilence1.1-MAN1A1-shRNA和過表達載體pYr-MAN1A1通過LR體外同源重組分別與pAd/PL-DEST腺病毒骨架質(zhì)粒構(gòu)建重組腺病毒載體pAd-MAN1A1-shRNA和pAd-MAN1A1,酶切和測序鑒定正確后轉(zhuǎn)染至HEK 293細胞進行病毒的包裝和擴增,獲得MAN1A1干擾和過表達重組腺病毒。7.分別將MAN1A1干擾和過表達重組腺病毒感染HepG2.2.15細胞細胞,同時設(shè)置對應的對照組和基夫堿處理組。感染48h后用Western Blot和RT-PCR法檢測各處理組MAN1A1基因和蛋白的表達水平,并收集不同處理組的上清,植物凝集素ELISA檢測乙肝表面抗原的甘露糖修飾程度。實驗結(jié)果1.收集到了三個組(免疫耐受組、慢性乙型肝炎組、非活動性HBsAg攜帶組)共90名HBV感染者和30名健康對照者的外周血,并完成各項指標的檢測；2.和健康對照組相比,三個HBV感染者組MAN1A1、MAN1A2和MAN1C1的表達均出現(xiàn)明顯的上調(diào),其中免疫耐受組的患者上調(diào)幅度最大(分別為0.66±0.19、0.66±0.18和0.56±0.15,p0.05), CHB組次之。三個HBV感染者組IL-12和IFN-γ水平顯著高于健康對照組(p0.05),其中以CHB組最高(IL-12:59.08±13.38 pg/ml, IFN-γ:43.66±12.50pg/ml,p0.05),其次為免疫耐受組：3.對于處于免疫耐受期的患者,MAN1A1、MAN1A2均與HBeAg滴度和HBV DNA水平呈線性正相關(guān),而MAN1C1僅與HBeAg滴度相關(guān)。CHB組的相關(guān)性分析顯示,MAN1A1、MAN1A2和MAN1C1的表達與ALT無相關(guān)性(p0.05),而與HBeAg和HBV DNA均呈正相關(guān)(r0.05,p0.01)；4.構(gòu)建了針對MAN1A1的干擾穿梭載體pBSilence 1.1-MAN 1A1-shRNA和過表達穿梭載體pYr-MAN1A1,酶切和測序結(jié)果顯示構(gòu)建成功；5.重組腺病毒載體pAd-MAN1A1-shRNA和pAd-MAN1A1構(gòu)建成功,酶切和測序鑒定正確,并通過HEK 293細胞包裝和擴增成功獲得了足夠的重組腺病毒：6.重組腺病毒pAd-MAN1A1-shRNA和pAd-MAN1A1感染HepG2.2.15細胞后,MAN1A1基因的表達水平分別出現(xiàn)下降和上調(diào),同時植物凝集素ELISA檢測發(fā)現(xiàn)HepG2.2.15上清中HBsAg分別出現(xiàn)高甘露糖和去甘露糖修飾。結(jié)論1.不同臨床階段慢性HBV感染者的PBMC普遍存在α-甘露糖苷酶Ⅰ的表達上調(diào),這種上調(diào)在免疫耐受期的患者最高。而且,免疫耐受組和CHB組α-甘露糖苷酶Ⅰ的表達水平與HBeAg滴度和HBVDNA水平均呈正相關(guān)。這些結(jié)果說明PBMC中α-甘露糖苷酶Ⅰ的表達上調(diào)可能在HBV的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用,而且表達水平與病毒復制的活躍程度密切相關(guān)：2.干擾和過表達α-甘露糖苷酶Ⅰ亞型MAN1A1的表達,可導致宿主細胞分泌HBsAg的甘露聚糖修飾發(fā)生變化,這進一步證實HBV可能通過影響宿主細胞a-甘露糖苷酶Ⅰ的表達,使乙肝表面抗原發(fā)生去甘露聚糖修飾,進而逃逸DC-SIGN的免疫識別。
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【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R512.62

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本文編號：2493024